Вплив умов гіпотермічного зберігання  на життєздатність іммобілізованої культури пробіотика Bifidobacterium bifidum

pages: 57-60

Г. Є. Ананьїна, І. П. Висеканцев, О. С. Онасенко, Л. В. Степанюк, В. Л. Пономарьова, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Відомо, що в кишечнику дорослої людини міститься близько 300-500 видів бактерій, які беруть безпосередню участь у процесі травлення. Під дією низки негативних факторів, таких як використання достатньо токсичних лікарських засобів (антибіотики, хіміопрепарати), а також зниження імунного статусу виникають порушення рівноваги кількісного та якісного складу кишкової мікрофлори (дисбіоз). Це негативно впливає на здатність кишечника до травлення і є основою клінічного прояву багатьох хвороб і розвитку алергічних реакцій [1, 6].

Відновлення порушеного мікробіоценозу кишечника є перспективним напрямом у комплексному лікуванні цілої низки захворювань, що супроводжуються дисбіо­зом. Використання пробіотиків, дія яких обумовлена, насамперед, антагоністичною активністю щодо умовно-патогенних бактерій, є одним з найбільш фізіологічних методів корекції дисбіозу [7].

Одним з пріоритетних спрямувань сучасної біотехнології є створення препаратів, іммобілізованих в альгінатних гранулах клітин пробіотиків, що дає змогу захистити їх від пошкоджувальної дії природних захисних бар’єрів травного тракту, транспортувати до біотопу локальні дози пробіотиків, підвищити шанси на колонізацію відповідних ділянок біотопу пробіотичними штамами [3, 9]. Вплив умов гіпотермічного зберігання на життєздатність і властивості іммобілізованих в гелевих носіях пробіотиків, зокрема Bifidobacterium bifidum, вивчено недостатньо.

Тому метою нашого дослідження було визначення життєздатності іммобілізованого в гранулах альгінату натрію з додаванням захисного сахарозо-молочно-лактозного (СМЛ) середовища культури пробіотика B. bifidum після зберігання за різних температур.

Матеріали та методи дослідження

вгору

Об’єктом досліджень були бактерії B. bifidum, штам 1, що були отримані з ФБУН «Московський науково-дослідний інститут епідеміології і мікробіології ім. Г. Н. Габрічевського» Росспоживнагляду (РФ).

Культуру бактерій B. bifidum вирощували в напівагаровому живильному середовищі Блаурока [4] за температури 37 °C упродовж 48 год.

Бактерії відмивали тричі фізіологічним розчином від ростового середовища шляхом центрифугування при 2000g і ресуспендували у фізіологічному розчині для отримання бактеріальної суспензії, яку змішували з 2% розчином альгінату натрію у співвідношенні 1:1.

У другій частині експерименту до клітин додавали рідке захисне СМЛ-середовище (сахарози – 2%, молока знежиреного – 5%, лактози – 1%) [5]. Отриману суспензію клітин у захисному середовищі також змішували з 2% розчином альгінату натрію у співвідношенні 1:1, кінцева концентрація альгінату натрію – 1%.

Отримані суміші набирали в шприц фірми Becton Dickinson (Німеччина) об’ємом 2 мл і діаметром голки 0,6 мм і крапали в 0,2М розчин CaCl2 для утворення гранул, які витримували у розчині впродовж 20 хв для їх стабілізації Ca-альгінатною оболонкою [11, 12].

Після стабілізації в розчині CaCl2 гранули промивали стерильним фізіологічним розчином і підсушували на стерильному фільтрувальному папері. Концентрація біфідобактерій у гранулах альгінату натрію становила 109 кл./мл, а в гранулах альгінату натрію з додаванням захисного середовища СМЛ – 108 кл./мл.

Після цього гранули розкладали по 10 штук у кріо­пробірки фірми Nunc (США) з робочим об’ємом 1,0 мл і розміщали їх на довгострокове зберігання за температур 4; ‒12; ‒20; ‒80; ‒196 °C. Охолодження зразків до 4 °C і заморожування до ‒12; ‒20 та ‒80 °C проводили з неконтрольованими швидкостями шляхом вміщення кріопробірок у холодильні камери. Заморожування зразків до ‒196 °C проводили шляхом безпосереднього занурення кріопробірок у рідкий азот. Зразки зберігали за температури 4; ‒12; ‒20; ‒80; ‒196 °C упродовж 12 міс (термін спостереження).

Контролем були іммобілізовані клітини культури пробіотика B. bifidum у гранулах альгінату натрію (контроль № 1) і в гранулах альгінату натрію із захисним середовищем СМЛ (контроль № 2) до зберігання.

Відігрів зразків після заморожування і зберігання за низьких температур проводили на водяній бані за температури 37 °C.

Гелеві гранули з іммобілізованими клітинами розчиняли в 4% розчині ЕДТА (ЕДТА-Na2 ·2H2O, Торговий Дім «Хотей», Китай) [10], для чого 10 гранул вміщали в 10 мл розчину ЕДТА. Після розчинення гранул з отриманої суспензії робили серійні розведення на фізіологічному розчині з наступним культивуванням у живильному середовищі Блаурока.

Життєздатність культури B. bifidum визначали шляхом підрахунку макроколоній, які формувалися в напівагаровому середовищі Блаурока після інкубування зразків за температури 37 °C упродовж 48 год (колонієутворювальні одиниці – КУО).

Культуральні властивості B. bifidum визначали за допомогою візуальної оцінки макроколоній, що сформувалися в живильному середовищі Блаурока.

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою методу Ст’юдента–Фішера з використанням програми Exсel (Microsoft, США). Дані наводили у lg числа КУО/мл. Відмінності вважали статистично значущими при р < 0,05 [2].

Результати та їх обговорення

вгору

Було проведено 2 серії експериментів:

а) зберігання клітин B. bifidum, іммобілізованих у гранулах 1% гелю альгінату натрію (варіант 1);

б) зберігання клітин B. bifidum, іммобілізованих у гранулах 1% гелю альгінату натрію з додаванням захисного середовища СМЛ (варіант 2).

Встановлено, що після зберігання іммобілізованих у гранулах альгінату натрію біфідобактерій протягом однієї доби за температур 4, ‒12, ‒20 °C їх життєздатність значуще знизилась з 9,52 (контроль № 1) до 7,39-7,3 lg КУО/мл. Життєздатність іммобілізованих в альгінатних гранулах біфідобактерій після зберігання впродовж 1 доби за температури ‒80 і ‒196 °C залишилась на вихідному рівні.

Додання захисного середовища СМЛ забезпечувало збереження через 1 добу кількості життєздатних клітин на вихідному рівні в усіх дослідних зразках за всіх температур зберігання (рис. 1).

kiai20_3_5760_r1-300x184.jpg

Рис. 1. Життєздатність іммобілізованої культури B.bifidum після зберігання за різних температур упродовж 1 доби: ■ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію; □ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію з доданням захисного середовища СМЛ; * різниця статистично значуща порівняно з контролем №1 (p ˂ 0,05)

Життєздатність іммобілізованих біфідобактерій, що зберігали за температури 4 °C впродовж 1 міс, знизилася з 9,52 до 3,3 lg КУО/мл (1-й варіант) і з 8,85 до 3,9 lg КУО/мл (2-й варіант). Через 3 міс зберігання в таких умовах бактерії загинули (рис. 2).

kiai20_3_5760_r2-300x138.jpg

Рис. 2. Життєздатність іммобілізованої культури B. bifidum після зберігання за температури 4 °С: ■ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію; □ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію з доданням середовища СМЛ; * різниця статистично значуща порівняно з контролем №1; # різниця статистично значуща порівняно з контролем №2 (p ˂ 0,05)

Життєздатність іммобілізованих біфідобактерій, що зберігали за температури –12 °C упродовж 1 міс, знизилася з 9,52 до 3,54 lg КУО/мл (1-й варіант) і з 8,85 до 4,25 lg КУО/мл (2-й варіант). Через 3 міс зберігання в цих умовах бактерії (варіант 1) загинули (рис. 3).

kiai20_3_5760_r3-300x144.jpg

Рис. 3. Життєздатність іммобілізованої культури B. bifidum після зберігання за температури –12 °С: ■ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію; □ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію з доданням середовища СМЛ; * різниця статистично значуща порівняно з контролем №1; ≠ різниця статистично значуща прівняно з контролем №2 (p ˂ 0,05)

Під час зберігання біфідобактерій, іммобілізованих у гранулах 1% альгінату натрію з доданням захисного середовища СМЛ, за температури ‒12 °C упродовж 3 міс показники життєздатності знизилися з 8,85 до 1,75 lg КУО/мл. Через 6 міс бактерії (варіант 2) загинули.

За температури –20 °C кількість життєздатних іммобілізованих у гранулах 1% альгінату натрію біфідобактерій через 1 міс знизилась з 9,52 до 4,65 lg КУО/мл, а через 6 міс – до 3,0 lg КУО/мл (рис. 4).

kiai20_3_5760_r4-300x166.jpg

Рис. 4. Життєздатність іммобілізованої культури B. bifidum після зберігання за температури –20 °С: ■ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію; □ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію з доданням середовища СМЛ; * різниця статистично значуща щодо контролю №1; ≠ різниця статистично значуща щодо контролю № 2 (p ˂ 0,05)

Життєздатність іммобілізованих біфідобактерій (варіант 2) значуще знизилась у порівнянні з контролем, але перевищувала показники варіанта 1. При збільшенні терміну зберігання дослідні зразки (варіанти 1, 2) загинули.

kiai20_3_5760_r5-300x158.jpg

Рис. 5. Життєздатність іммобілізованої культури B. bifidum після зберігання за температури –80 °С: ■ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію; □ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію з доданням середовища СМЛ; * різниця статистично значуща щодо контролю №1; ≠ різниця статистично значуща щодо контролю № 2 (p ˂ 0,05)

Життєздатність іммобілізованих біфідобактерій (варіанти 1,2), що зберігали за температури –80 і –196 °C упродовж 12 міс, не відрізнялась від контролю (рис. 5, 6).

kiai20_3_5760_r6-300x158.jpg

Рис. 6. Життєздатність іммобілізованої культури B. bifidum після зберігання за температури –196 °С: ■ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію; □ – клітини біфідобактерій у гранулах 1% альгінату натрію з доданням середовища СМЛ; * різниця статистично значуща щодо контролю №1 (p ˂ 0,05)

На рисунку 7 показано гранули 1% альгінатного гелю без захисного середовища СМЛ та з його доданням.

kiai20_3_5760_r7-300x176.jpg

Рис. 7. Гранули іммобілізованої культури пробіотика B. bifidum, ×6: а – іммобілізовані клітини B. bifidum у гранулах 1% альгінату натрію; б – іммобілізовані клітини B. bifidum у гранулах 1% альгінату натрію з доданням захисного середовища СМЛ

Вивчали культуральні властивості пробіотика B. bifidum після іммобілізації в гранулах 1% альгінатного гелю без та з доданням захисного середовища СМЛ і після зберігання за різних температур.

kiai20_3_5760_r8-300x121.jpg

Рис. 8. Макроколонії B. bifidum у живильному середовищі Блаурока, зберігання іммобілізованих у гранулах 1% альгінату натрію біфідобактерій за різних температурних умов: 1 – контроль № 1; 2 – після зберігання за температури 4 °С; 3 – після зберігання за температури –12 °С; 4 – після зберігання за температури –20 °С; 5 – після зберігання за температури –80 °С; 6 – після зберігання за температури –196 °С

Формування макроколоній біфідобактерій до і після зберігання в умовах гіпотермії відзначали через 48 год культивування у живильному середовищі Блаурока. Характеристики макроколоній B. bifidum після іммобілізації та зберігання за вказаних температурних режимів не відрізнялися від контролю впродовж всього дослідного терміну (рис. 8, 9).

 

kiai20_3_5760_r9-300x121.jpg

Рис. 9. Макроколонії B. bifidum у живильному середовищі Блаурока, зберігання іммобілізованих у гранулах 1% альгінату натрію з доданням захисного середовища СМЛ біфідобактерій за різних температурних умов: 1 – контроль № 2; 2 – після зберігання за температури 4 °С; 3 – після зберігання за температури –12 °С; 4 – після зберігання за температури –20 °С; 5 – після зберігання за температури –80 °С; 6 – після зберігання за температури –196 °С

Висновки

вгору

Показано, що на життєздатність клітин культури B. bifi­dum, іммобілізованих у гранулах 1% розчину альгінату натрію, впливають як температурні режими зберігання, так і модифікація гелю з додаванням до нього захисного середовища СМЛ. За температур –80, –196 °C іммобілізовані бактерії не гинуть упродовж 12 міс (термін спостерігання). Іммобілізована в гранулах альгінату натрію пробіотична культура B. bifidum залишалася життєздатною за температур зберігання 4 °C та –12 °C упродовж 1 міс, а за температури –20 °C іммобілізовані біфідобактерії гинули в термін від 6 міс.

Показаний захисний ефект середовища СМЛ на життєздатність іммобілізованих клітин. При зберіганні зразків (варіант 2) в умовах –12 °C біфідобактерії залишалися життєздатними до 3 міс, а за температури –20 °C кількість життєздатних клітин у дослідних зразках (варіант 2) була значуще вищою, ніж у варіанті 1, також збільшувався термін зберігання. Показано, що культуральні властивості іммобілізованих клітин не відрізнялися від контролю протягом 12 міс незалежно від умов зберігання.

Список літератури

1. Микроэкологические нарушения при клинической патологии и их коррекция бифидосодержащими пробиотиками / А. А. Воробьев, В. М. Бондаренко, Е. А. Лыкова, А. В. Григорьев, Т. М. Мацулевич. Вестник РАМН. 2004. № 2. С. 13-17.

2. Лакин Г. Ф. Биометрия. Учебное пособие для биол. спец. вузов. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

3. Лясковский Т. М., Подгорский В. С. Оценка пробиотиков, согласно рекомендациям международных организаций (FAO/WHO) [Текст]. Микробиол. журн. 2005. Т. 67. № 6. С. 104-112.

4. Поляк М. С., Сухаревич В. И., Сухаревич М. Э. Питательные среды для медицинской микробиологии. СПб., 2002. 80 с.

5. Спосіб консервування культури Bifidobacterium bifidum ЛВА-3 / Г. Є. Ананьїна, А. М. Гольцев, І. П. Висеканцев та ін.: пат. 56674 Україна: МПК С12N1/04; заявл. 18.06.10; опубл. 25.01.11, Бюл. № 2. 4 с.

6. Ткач С. М., Пучков К. С., Сизенко А. К. Кишечная микробиота в норме и при патологии. Современные подходы к диагностике и коррекции кишечного дисбиоза. К.: Твиса ЛТД, 2014. 149 с.

7. Токарева Н. Коррекция и профилактика дисбактериоза. Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. 2011. № 3. С. 77-85.

8. The role of the gut microbiota in nutrition and health / H. J. Flint, K. P. Scott, P. Louis, S. H. Duncan. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2012 Sep 4;9(10):577-89. doi: 10.1038/nrgastro.2012.156. eCollection 2012.

9. Ding W.K., Shah N.P. Effect of various encapsulating materials on the stability of probiotic bacteria. J Food Sci. 2009 Mar;74(2): M100-7. doi: 10.1111/j.1750-3841.2009.01067.x.

10. Peek L. J., Middaugh C. R., Berkland C. Nanotechnology in vaccine delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 2008. Vol. 60. № 8. P. 915-928.

11. Sharma A., Sharma S., Khuller G. K. Lectin-functionalized poly (lactide-co-glycolide) nanoparticles as oral/aerosolized antitubercular drug carriers for treatment of tuberculosis. J. Antimicrob. Chemother. 2004. Vol. 54. № 4. Р. 761-766.

12. Zelikin A. N., Ehrhardt C., Healy A. M. Materials and methods for delivery of biological drugs. Nature Chemistry. 2016. Vol. 8. № 11. P. 997-1007.

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ГИПОТЕРМИЧЕСКОГО ХРАНЕНИЯ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ КУЛЬТУРЫ ПРОБИОТИКА BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM

А. Е. Ананьина, И. П. Высеканцев, Е. С. Онасенко, Л. В. Степанюк, В. Л. Пономарева

Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины

Резюме

В статье представлены данные по влиянию условий хранения при температурах 4, ‒12, ‒20, ‒80 и ‒196 °C в течение 12 мес на жизнеспособность и культуральные свойства иммобилизованной в гранулах 1% альгината натрия культуры пробиотика Bifidobacterium bifidum. Установлено, что хранение при температурах ‒80 и ‒196 °C обеспечивало высокую жизнеспособность бифидобактерий на протяжении всего срока исследования. Добавление защитной сахарозо-молочно-лактозной среды при иммобилизации обеспечивало криозащитный эффект, более высокие показатели жизнеспособности, сохранности свойств и длительности хранения в условиях гипотермии.

Ключевые слова: пробиотики, иммобилизация, альгинатные гранулы, гипотермическое хранение, хранение при низких температурах, сахарозо-молочно-лактозная защитная среда, жизнеспособность.

HYPOTHERMIC STORAGE EFFECT ON VIABILITY OF BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM PROBIOTIC IMMOBILIZED CULTURE

A.Ye. Ananina, I. P. Vysekantsev, Ye. S. Onasenko, L. V. Stepanyuk, V. L. Ponomaryova

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of NANS of Ukraine

Abstract

The paper comprises the data on the effect of storage conditions at temperatures of 4, –12, –20, –80 and –196 °C on viability and cultural pro­perties of immobilized in 1% sodium alginate granules of the Bifidobacterium bifidum probiotic culture for 12 months. It has been established that the storage at –80 and –196 °C provided a high viability of bacteria within the whole term of study. Supplementing with sucrose-milk-lactose medium during immobilization contributed to its cryoprotective effect, higher survival rates, preserved properties and duration of storage under hypothermia conditions.

Key words: probiotics, immobilization, alginate granules, hypothermal storage, low temperature storage, sucrose-milk-lactose protective medium, viability.

Our journal in
social networks:

This Year Issues

3-4 (124-125)

Contents Of Issue 3-4 (124-125), 2020

  1. Д.В. Мальцев

  2. Б.М. Пухлик

  3. В. Зайков, П. В. Гришило, А. П. Гришило

  4. A. G. Corsico, S. Leonardi, . A. Licari et al.

  5. О. С. Бильченко, Т. С. Оспанова, В. А. Савоськина, Е. А. Красовская, О. В. Веремеенко

  6. M. Levin, I.J. Ansotegui, . J. Bernstein et al.

  7. A. Bedard, X. Basagana, . J.M. Anto et al.

  8. Г. Є. Ананьїна, І. П. Висеканцев, О. С. Онасенко, Л. В. Степанюк, В. Л. Пономарьова

2 (123)
1 (122)