Концепция диагностики иммунной недостаточности на основе определения уровня защитных белков в секретах

Введение
Большинство аллергических и инфекционно-воспалительных заболеваний связаны с развитием патологических процессов в слизистой оболочке, которая, например, в области верхних дыхательных путей задерживает и элиминирует около 70% поступающего извне инертного и агрессивного антигенного материала. Нарушения в механизмах резистентности слизистой, включая структурные отклонения в ее сложном морфофункциональном аппарате, приводят к развитию различных патологических процессов.
Значительная контактная поверхность слизистых оболочек (200-330 м² и более) предполагает постоянную и основную агрессию со стороны макро- и микромира и защиту от нее благодаря наличию защитных механизмов специфического и неспецифического характера и специализированных структур (рис. 1 ).
На протяжении последних десятилетий сложилось мнение, что основными гуморальными факторами защиты слизистых оболочек являются секреторные иммуноглобулины классов А и М и ряд белково-углеводных соединений – протеазы и антипротеазы слюны, лизоцим, лактоферрин, гликопротеиды слизи [3, 9, 11, 21]. Клеточные защитные ряды представлены прежде всего эпителиальными клетками (около 5 разновидностей), мигрирующими ТγΔ-лимфоцитами, макрофагами, тканевыми базофилами, дендритными клетками. Вторая «линия обороны» может быть представлена сывороточными иммуноглобулинами, фагоцитирующими клетками, ТγΔ- и NK-лимфоцитами [1, 6, 20].

Иммуноглобулины как основная диагностическая компонента
Недостаточность образования антител – основного специфического защитного фактора иммунитета – следствие и интегральное выражение нарушения количественных и функциональных характеристик взаимодействия в процессах иммуногенеза клеток лимфоидного и нелимфоидного рядов, включая цитокиновую регуляцию [5, 15]. В связи с этим определение уровня иммуноглобулинов различных классов и антител к отдельным антигенам в сыворотке крови, выявление количественных характеристик отдельных групп клеток часто являются решающим фактором в установлении иммунодефицитного состояния [5, 16].
Наиболее частым клиническим проявлением селективного иммунодефицита IgA или длительной гипоглобулинемии являются рецидивирующие инфекционно-воспалительные заболевания респираторного тракта и среднего уха: хронические риносинуиты, гнойные отиты, бронхиты, воспаления лимфоидных структур глотки и зубодесневой системы [2, 5, 14]. Наряду с этим в иммунологической характеристике больных с общей вариабельной иммунологической недостаточностью (ОВИН) и рецидивирующими воспалительными и аллергическими процессами верхних дыхательных путей определению секреторного IgA (sIgA) в слюне и других секретах верхних дыхательных путей отводится второстепенное значение. Нами [9] высказана гипотеза о возможности диагностики состояния иммунной недостаточности организма неинвазивным методом по определению иммуноглобулинов и других защитных белков в секретах организма, прямо или косвенно контактирующих с внешней средой.
Основу концепции составляет гипотеза о том, что для организма человека наиболее важно сохранение равновесного состояния слизистых оболочек с макромиром и микроорганизмами, что требует больше локальных защитных белков, чем сывороточных. Из многих известных гуморальных механизмов защиты слизистых оболочек наиболее эффективными сегодня признаны иммуноглобулины (антитела) класса А, прежде всего полимерные формы. Отклонение (как правило, снижение) в концентрации их основных форм, а также изменения в соотношении представителей отдельных классов иммуноглобулинов и других защитных белков, например лактоферрина и лизоцима, могут быть основанием для диагностики иммунной недостаточности (вторичного иммунодефицита).

Аргументы в пользу концепции
В лаборатории патофизиологии и иммунологии и в отделении воспалительных заболеваний Института оториноларингологии имени А.И. Коломийченко АМН Украины у больных рецидивирующими воспалительными заболеваниями рото- и носоглотки, тканей пародонта проведены исследования уровней sIgA, иммуноглобулинов классов А, Е, G, лактоферрина в смешанном ротоглоточном секрете и слезной жидкости, параллельно изучено содержание некоторых субпопуляций лимфоцитов и иммуноглобулинов основных классов в крови, дан анализ изменений в локальных и системных факторах иммунитета.
Материалом для анализа послужили данные иммунологических исследований у 1 050 больных с инфекционно-воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей (тонзиллитом, аденоидитом, синуитом, фарингитом), а также отитом и пародонтитом в возрасте от 8 до 50 лет и 150 здоровых доноров. Среди 16 параметров, характеризующих состояние системного и местного иммунитетов, для анализа отобраны следующие:
• число Т-, В- и NK-лимфоцитов в периферической крови;
• уровень иммуноглобулинов классов A, Е, G, М в сыворотке крови;
• концентрация sIgA в ротоглоточном секрете и слезной жидкости.
Количественные характеристики трех основных популяций лимфоцитов (Т, В, NK) определяли преимущественно методом моноклональных антител (Сорбент, Москва) и люминесцентной микроскопической техники, с помощью которых выявляли Т (CD3), B (CD20), NK (CD56) клетки среди смешанной популяции лимфоцитов крови [12].
Иммуноглобулины в сыворотке крови, слюны и слезной жидкости изучали методом радиальной иммунодиффузии в геле по Manchini в модификации Simmons (1971), а также с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) («Вектор-Бест», Новосибирск; «Укрмедсервис», Донецк).
Кроме того, иммуноцитохимическому анализу подвергали клетки небных и носоглоточной миндалин, удаленных по медицинским показаниям у больных в возрасте от 9 до 22 лет, у которых патология со стороны структур лимфоглоточного кольца сочеталась с фарингитом, риносинуитом, пародонтитом. Результаты этих испытаний сравнивали с данными аналогичных исследований удаленной ткани у детей в возрасте 9-12 лет с гипертрофией небной и носоглоточной миндалин без клинических проявлений сопутствующей патологии. Определяли содержание клеток на наличие CD20 (моноклональных антител LEU) и количество клеток, продуцирующих антитела класса А (меченые флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ) глобулины кролика против F (ab)2 IgA человека, Calbiochem), применяя методы прямой и непрямой иммунофлюоресценции и люминесцентную микроскопическую технику [19]. Статистическую обработку и анализ полученных результатов выполняли с использованием непараметрических критериев и метода углового преобразования по Фишеру.
От 25 до 35% больных хроническими рецидивирующими заболеваниями верхних дыхательных путей имели отклонения в содержании всех трех типов лимфоцитов. Наиболее рельефным было снижение числа В-лимфоцитов (менее 0,3 Т/л) у тонзиллэктомированных больных с явлениями хронического атрофического фарингита. Относительное снижение основных типов лимфоцитов при различных патологических процессах среди обследованных было в пределах 20-40% для Т, 30-45% – для В и 5-17% – для NK-лимфоцитов.
При анализе уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови учитывали отсутствие всех или одного из классов иммуноглобулинов, снижение суммарного количества Ig (A+G+М) < 7 г/л или sIgA в ротоглоточном секрете < 0,8 мг/мл и слезной жидкости < 0,5 мг/мл. Агаммаглобулинемия при данных заболеваниях не выявлена, селективный дефицит IgA сыворотки обнаружен в одном случае из 110 человек у больных хроническим тонзиллитом и в одном случае из 57 больных при хроническом гнойном отите; гипоиммуноглобулинемия – от 8,9 до 17% при различных заболеваниях верхних дыхательных путей (табл. 1).
Наиболее рельефны и значимы были отклонения в содержании sIgА как в слюне, так и в слезной жидкости (практически при всех заболеваниях отмечено его снижение более чем на 50%). В таблице 2 представлены данные о содержании В-лимфоцитов и IgA-продуцентов в ткани различных структур лимфоглоточного кольца у часто болеющих пациентов. Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что у данной категории больных количество В-лимфоцитов и IgA-продуцентов достоверно ниже, чем у детей с гипертрофией миндалин без воспалительных процессов в других отделах дыхательных путей.
Колебания в содержании лактоферрина в ротоглоточном секрете, по всей вероятности, связаны с остротой процесса: содержание этого белка было повышено при обострениях и более низкое при ремиссии.
Существенное значение имели средние показатели иммуноглобулинов класса А – мономерной (сывороточной) и димерной (секреторной) форм, а также IgG, который считается провоспалительным фактором, поскольку в комплексе с антигеном способен фиксировать компоненты комплемента и вызывать деструкцию тканей. При хронических процессах и наличии системной недостаточности иммунитета, как правило, наблюдаются снижение sIgA, повышение мономерного IgA, а также IgG. В условиях нормы в секретах ротоглотки и слезной жидкости концентрации IgA и IgG не превышают 0,2 г/л, при рецидивирующих хронических воспалительных процессах верхних дыхательных путей эти показатели увеличиваются в несколько раз. На рисунке 2 приведено соотношение содержания различных иммуноглобулинов в ротоглоточном секрете у больных хроническим тонзиллитом и у практически здоровых лиц.
Результаты исследований по определению клеточных и гуморальных факторов иммунитета – местного и системного – свидетельствуют о том, что в оценке состояния иммунологической недостаточности, в том числе ОВИН, связанной с дефицитом антителообразования, снижение содержания sIgА в ротоглоточном секрете и слезной жидкости следует рассматривать как проявление определенного дефекта в дифференцировке В-лимфоцитов в индуктивных зонах, прежде всего в структурах лимфоглоточного кольца. По данным Brandzaeg (1996), В.В. Кищука (2001), содержание B- и IgA-дифференцирующихся лимфоцитов в ткани небных миндалин при хроническом тонзиллите снижается более чем в 2,5 раза по сравнению с нормой. При рецидивирующих отитах, ринофарингитах и синуитах, по данным ряда авторов, в лимфаденоидной ткани кольца Пирогова-Вальдейера также снижен уровень sIg и В-лимфоцитов, дифференцирующихся в направлении их синтеза, в слюне – уровень sIgА [4, 7, 23].
Учитывая, что сывороточные иммуноглобулины имеют период полураспада от 2,5 до 28 дней [18], а секреторные выводятся в связанном виде из зон активного взаимодействия в течение 1-2 суток [21], можно полагать, что задействованность лимфодных и нелимфоидных клеток, участвующих в продукции sIg, значительно превосходит таковую при продукции сывороточных. Элементарный анализ показывает, что количество секретов, омывающих и защищающих поверхность всех слизистых оболочек человека, приближается к 10 л в сутки и практически ежедневно требует смены иммуноглобулинового состава, в основном sIgA, тогда как сыворотка крови, имеющая объемную характеристику в 2-3 л, содержит медленно обновляющийся иммуноглобулиновый компонент. Это дает основания полагать, что количество необходимого sIgА в здоровом организме значительно превосходит данный показатель у всех классов сывороточных иммуноглобулинов. Ориентировочный расчет содержания белка в секретах и сыворотке представлен в таблице 2.
Таким образом, определение уровня секреторных иммуноглобулинов в слюне, слезной жидкости или ротоглоточном секрете является важнейшим компонентом как в характеристике, так и в диагностике иммунодефицитных состояний при инфекционно-воспалительной патологии дыхательных путей, связанной с инфекционно-аллергическими воспалительными процессами в слизистой оболочке, включая ОВИН. Исследование уровня sIgA при патологических процессах на слизистой дыхательных путей более простое, экономичное и информативное, нежели выявление количественных характеристик иммунокомпетентных клеток и уровня иммуноглобулинов различных классов в крови.
Кроме того, совместно с сотрудниками медицинских учреждений МЗ и АМН Украины мы проведели исследования уровней иммуноглобулинового состава других секретов и выделений (желчи, кала) и показали сходство отклонений в векторе и количественной характеристике защитных белков при холангитах и колитах, что позволяет предполагать универсальность характера изменений в содержании иммуноглобулинов в различных секретах организма при наличии иммунной недостаточности.

Литература
1. Беляков И.М. Иммунная система слизистих // Иммунология. –1997. – № 4. – С. 7-13.
2. Борисова А.М. Проблемы иммунотерапии общей вариабельной иммунной недостаточности у взрослых. Intern J Immunorehabilitation 1998; 10: 118-125.
3. Быкова В.П. Структурные основы мукозального иммунитета верхних дыхательных путей // Российская ринология. – 1999. – № 1. – С. 5-11.
4. Быкова В.П., Антонова Н.А., Юнусов А.С., Архангельская И.Н. Клинико-морфологический анализ аденоидных вегетаций // Вестник оториноларингологии.– 2000. – № 5. – С. 9-12.
5. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. – К.: Полиграф-Плюс, 2006. – 480 с.
6. Кайдашев И.П., Волошина Л.И., Караснюк О.А. Шинкевич В.И. и др. Роль дендритных клеток в обеспечении локального иммунитета полости рта // Український стоматологічний альманах. – 2001. – № 5.– С. 80-87.
7. Кищук В.В. Клініко-імунологічні підходи до оцінки функціонального стану піднебінних мигдаликів для діагностики та лікування хворих на хронічний тонзиліт: Автореф. дис. … докт. мед. наук. – К., 2001. – 35 с.
8. Мельников О.Ф., Заболотный Д.И., Потапов Э.В. Иммунотропное действие тиотриазолина на клетки глоточной миндалины in vitro // Журнал вушних, носових і горлових хвороб. – 2002. – № 1. – С. 29-33.
9. Мельников О.Ф., Заболотный Д.И. Диагностика иммунодефицитов при патологии слизистой оболочки на основе определения иммуноглобулинов в секретах. – К.: Институт оториноларингологии им. Коломийченко АМН Украины, 2003. – 31 с.
10. Мельников О.Ф., Веремеенко К.М., Тимченко С.В., Кизим О.І. та ін. Імунобіохімічна характеристика ротоглоткового секрету у хворих на запальні захворювання ЛОР-органів // Імунологія та алергологія. – 2006. – С. 110.
11. Пискунов С.З. Физиология и патофизиология носа и околоносовых пазух // Российская ринология. – 1993. – № 1. – С. 19-39.
12. Сидоренко С.П. Поверхностные антигены клеток человека, систематизированные международными рабочими совещаниями по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека // Імунологія та алергологія. – 1998. – № 3. – С. 16-38.
13. Brandtzaeg P. The B-cells Development in Tonsilar Lymphoid follicles. Acta Otolaryngol (Stockh) 1996; 523: 55-59.
14. Сuningham-Ruddles C. Clinical and immunological analysis of 103 patients with common variable immunodeficiency. J Clin Immunol 1989; 10: 22-23.
15. Dinarello C.A. IL-18: inducing proinflamatory cytokine and new member of the IL-1 family. Allerg Clin Immunol 1999; b. 103. – № 1. – Р. 11-24.
16. Dobre V. The characteristics of bacterial respiratory infections in patients with humoral immunodeficiency // Pnumophiziologia. – 1992. – b. 42. – № 2-3. – P. 143-146.
17. Glantz S. Медико-биологическая статистика / Пер. с англ. – М.: Практика, 1999. – 460 с.
18. Jeske D.D., Capra D. Иммуноглобулины: строение и функции // Иммунология. – М.: Мир, 1987. – Т. 1. – С. 204-254.
19. Kubitza A. Иммунофлюоресценция / Пер. с польск. – Москва-Варшава: Мир, 1968. – 148 с.
20. Kato Y., Kondo N., Ozawa T., Motoyoshi F., Agata H. Kinetics of hypoglobulinemia in patint with common vatiable immunodeficiency // Acta Pediatr. – 1993. – b. 82. – № 9. – P. 739-743.
21. Lamm M. How epithelial transport IgA antybodies related to host defense. Amer J Physiol 1998; 4: 614-616.
22. Simmons P. Quantitation of plasma proteins in low concentrations using RID. Clin Chim Acta 1971; 35: 53-57.
23. Zanin C., Perrin Ph., Bene M., Perruchet A., Faure G. Antybody-producing cells in peripheral blood and tonsils after oral treatment of children with bacterial rybosomes. Intern J Immunopharmacol 1994; 16 (7): 497-505.