Перспективи трансплантації ембріональної нервової тканини при сенсоневральній приглухуватості

В оториноларингології, зокрема в клінічній аудіології, проблема лікування сенсоневральної приглухуватості посідає чільне місце. За даними ВООЗ, 5-8% населення страждають зниженням слуху, з яких 65-93% – сенсоневральною приглухуватістю. Недостатня ефективність лікування цієї патології, незважаючи на велику кількість запропонованих методів, змушує шукати нові шляхи вирішення даної проблеми. Головну роль у патогенезі сенсоневральної приглухуватості відіграє вплив різних патологічних факторів на волоскові клітини спірального органу. До пошкоджуючих факторів, які часто призводять до загибелі волоскових клітин внутрішнього вуха, відносять шум, вібрацію, бактеріальну та вірусну інфекції, ототоксичні лікарські засоби. У віці 40-45 рокiв можлива поступова iнволюцiя спірального органу, що починається з базальних завиткiв та супроводжується зниженням слухової чутливостi – пресбіакузисом. 
Спіральний орган – це сукупність нейроепiтелiальних клiтин, якi забезпечують перетворення звукового подразнення на фiзiологiчний акт звукової рецепцiї. В нейроепiтелiї спірального органу розрiзняють чутливi та пiдтримуючi клiтини. Вiдносно внутрiшнього тунелю волоскові клiтини подiляють на внутрiшнi та зовнiшнi. У людини приблизно 3,5-4 тис. внутрiшнiх та 20 тис. зовнiшнiх волоскових клiтин. У дослідженнях R.A. Baird, M.A.Torres (1993) [16] підтверджено, що у риб та амфібій волоскові клітини відновлюються протягом усього життя, при пошкодженні можуть заміщуватись. У птахів та ссавців слухові волоскові клітини продукуються тільки до народження [22], проте у птахів вони зберігають можливість до регенерації. Загибель у них волоскових клітин індукує мітоз та диференціацію підтримуючих клітин, що заміщують їх у місці пошкодження [26]. Встановлено, що підтримуючі клітини, які широко представлені в слуховому та вестибулярному епітелії хребетних, можуть ділитися. Нові клітини, що з’являються в результаті поділу, мають здатність надалі диференціюватися у волоскові чи підтримуючі клітини. Підтримуючі клітини часто виживають після пошкоджень, внаслідок чого гинуть розташовані поряд волоскові клітини. Підтримуючі клітини, що вижили, мають здатність бути джерелом нових епітеліальних клітин. Це положення правильне для всіх хребетних, включаючи ссавців [22]. 

Застосування ембріональних тканин та клітин у медицині
В останнє десятиріччя в імунології, ембріології та трансплантології успішно розробляють методи трансплантації ембріональних тканин та клітин, які мають унікальні властивості, характерні тільки для клітин та тканин, що знаходяться на ранніх стадіях цитогенетичного розвитку [12]. До цих властивостей відносять: 
1. Високі адаптаційні можливості, які реалізуються за рахунок росту, міграції, здатності утворювати міжклітинні контакти, пов’язані з підвищеною кількістю бластних клітин. 
2. Наявність та продукування великої кількості біологічно активних речовин: факторів росту, a-фетопротеїнів, антиоксидантів, адаптогенів, протизапальних та бактеріостатичних сполук, пептидів, які стимулюють імунокомпетентні клітини. 
3. Високу стійкість до гіпоксії за рахунок використання гліколізу. 
4. Відсутність імунної реакції відторгнення, оскільки в І та ІІ триместрах гестації ще не експресуються білки головного комплексу гістосумісності І та ІІ класів. 
5. Стерильність (плід, знаходячись у матці, захищений від дії мікроорганізмів). 
Терапія за допомогою ембріональних тканин включає в себе специфічні (замісні) та неспецифічні механізми, які ґрунтуються на модуляції процесів регенерації, репарації, проліферації та диференціювання і реалізуються на генетичному та епігеномному рівнях. Розкриття цих механізмів може бути вирішальною умовою для розробки нових методів терапії патологічних станів, пов’язаних із порушенням морфогенезу, і, насамперед, онкологічних захворювань [13].
До захворювань, при яких можливе застосування ембріональних тканин, належать: 
• травми, опіки, трофічні виразки, хронічні гнійні процеси; 
• хронічні хвороби центральної та периферичної нервової системи (паркінсонізм, епілепсія, дитячий церебральний параліч, пігментна дегенерація сітківки, сенсоневральна приглухуватість); 
• патологія печінки та підшлункової залози (гепатити, цукровий діабет та ін.); 
• злоякісні пухлини. 

Використання ембріональної нервової тканини (ЕНТ) при патології центральної та периферичної нервової системи 
Певний позитивний ефект, отриманий в ході експериментальних досліджень з вивчення властивостей ЕНТ при різних патологічних станах, забезпечив упровадження цього методу в клініку.
Вже на початку XX століття було успішно проведено трансплантацію тканини ембріонів або новонароджених тварин у головний мозок дорослих ссавців: молода нервова тканина прижилася і розвивалася тривалий час (до 7 місяців). Проте ці дослідження були поодинокими, і тоді на них не звернули особливої уваги.
Тільки з 1970 р. розпочався новий етап досліджень у галузі нейротрансплантології. У багатьох країнах світу стали проводити дослідження з трансплантації ембріональної нервової тканини в мозок ссавців (щурів, кролів, мавп). Були визначені умови, необхідні для приживлення трансплантата: ембріональна тканина повинна бути недиференційованою; пересаджувати потрібно невеликі за об’ємом фрагменти донорської тканини; важливо ретельно готувати ложе для трансплантата. За даними досліджень виявили, що при дотриманні цих умов трансплантати не тільки приживляються, але й диференціюються, розростаються, встановлюють тісні морфофункціональні зв’язки з мозком реципієнта.
В 1983 р. шведський нейрохірург О. Баклунд у Королівському госпіталі Стокгольма з нейробіологами Л. Олсоном і А. Зайгером виконали перші операції з нейротрансплантації у хворих із тяжкою формою паркінсонізму, в результаті чого було досягнуто поліпшення стану здоров’я пацієнтів. Надалі нейротрансплантації у хворих на паркінсонізм почали виконувати в США, Мексиці, Кубі, Китаї, Великобританії [23, 19, 20].
На сьогодні існують достовірні дані про ефективне застосування ЕНТ при епілепсії, шизофренії, дитячому церебральному паралічі, ішемічних ураженнях мозку [7, 14]. Нейротрансплантацію виконують більш ніж у 14 країнах світу, і діапазон нозологічних форм при цьому обширний – понад 20. Найбільшу кількість операцій (близько тисячі) виконано хворим на паркінсонізм. 
В Україні після численних експериментальних досліджень із 1989 р. почали проводити нейротрансплантацію хворим на дитячий церебральний параліч, згодом – хворим на апалічний синдром (26 осіб), ішемічний інсульт (19), з наслідками черепно-мозкової травми (6). Найбільшу кількість нейротрансплантацій (близько 400) проведено хворим на дитячий церебральний параліч [14, 15]. Встановлено, що хоча інтеграція ЕНТ з мозком реципієнта закінчується на 2-6-й місяць після трансплантації [1, 18], клінічний ефект, як правило, спостерігається вже в перші дні після операції [1, 8].
Щодо перспектив застосування ЕНТ при патології периферичної нервової системи виявлено ефективність трансплантації ембріональної нервової тканини у хворих на пігментну дистрофію сітківки, відсутність побічних реакцій [4]. Також з’явилися перші повідомлення про використання ЕНТ при сенсоневральній приглухуватості. Так, М.М. Магомедов [9] застосував ембріональну нервову тканину у вигляді гомогенату у 14 хворих на нейросенсорну приглухуватість ІІ-ІІІ-го ступенів із давністю захворювання від 6 місяців до 3 років. Гомогенат вводили ендолюмбально (3 пацієнта), меатотимпанально (4), ендоназально (6), в одному випадку – в перилімфатичний простір крізь основу стремені. Після одноразового застосування ЕНТ відбулося покращання слуху за даними тональної порогової аудіометрії в середньому на 10 дБ та аудіометрії в розширеному діапазоні частот на 5 дБ. Показники імпедансної аудіометрії та отоакустичної емісії в процесі лікування не змінилися. При порівнянні ефективності терапії (тривалість спостереження – 1 рік) методи ендолюмбальної та інтракохлеарної трансплантації, на думку автора, виявилися найбільш ефективними. 
В лабораторії культивування тканин Інституту нейрохірургії АМН України ім. А.П. Ромоданова ми провели експериментальне дослідження впливу ембріональної нервової тканини на пошкоджений сенсорний епітелій внутрішнього вуха щурів. 

Матеріали, методи та результати експериментального дослідження впливу ЕНТ на пошкоджений сенсорний епітелій внутрішнього вуха
Експерименти проводили на 22 білих нелінійних щурах віком 1-2 тижні з середньою вагою 50 г розводки віварію НДІ нейрохірургії АМН України ім. акад. А.П. Ромоданова. Спіральний орган щурів виділяли з внутрішнього вуха в стерильних умовах під бінокулярною лупою при 4-кратному збільшенні за допомогою набору мікроінструментів за модифікованим методом Я.А. Віннікова, Л.К. Титової [3]. Ембріональну нервову тканину отримували з тканини головного мозку ембріонів щурів пренатального періоду. Дисоціацію ЕНТ проводили за методом Mosconа у модифікації І.В. Вікторова [2].
В результаті прижиттєвих світло-оптичних спостережень контрольних експлантатів, одержаних зі спірального органу внутрішнього вуха щурів, встановлено, що вони зберігають свою життєздатність протягом 5-7 днів. У наступних експериментах з метою моделювання особливостей токсичної дії гентаміцину на експлантати зі спірального органу щурів проводили їх культивування при додаванні розчину цього антибіотика. Дозування концентрації препарату проводили спочатку із розрахунку 8 мкг на 1 мл культурального середовища. Це умовно відповідає середній терапевтичній концентрації цього засобу в 1 мл плазми крові пацієнта середньою вагою 70 кг при рівномірному розподілі його у крові. Така концентрація гентаміцину, за даними G.J. Matz [24], – клінічно ототоксична. Експозиція розчину гентаміцину з експлантатами, одержаними з внутрішнього вуха щурів, становила 24 години.
Гентаміцин (8 мкг/мл), який додавали в поживне середовище культур, призводив до повної десквамації епітеліальної поверхні експлантатів спірального органу, і тому така концентрація була визнана як токсична. Такі зміни клітинної поверхні експлантатів із внутрішнього вуха щурів після інкубації з гентаміцином свідчать про пошкоджуючий ефект дії цього антибіотика як на епітеліальний, так і на сполучнотканинний компоненти, а тестовану концентрацію можна вважати субтоксичною.
У наступній серії дослідів проводили сумісне культивування експлантатів із внутрішнього вуха щурів із додаванням дисоційованої ЕНТ з метою вивчення протекторного впливу ембріональної нервової тканини на пошкоджені гентаміцином експлантати. Спостереження живих та фарбованих культур цієї серії дослідів показали, що в такому варіанті експериментів епітеліальний компонент значною мірою зберігає типове розташування та побудову більшості клітин. Таким чином, результати проведених дослідів з експлантацією клітинного матеріалу з внутрішнього вуха щурів свідчать про можливість його приживлення протягом 7 діб зі збереженням життєздатності експлантатів та характерної морфології, що відповідає органотиповим особливостям.
Досліджена нами вдвічі менша концентрація гентаміцину (4 мкг/мл) викликає дистрофічні зміни лише в частині клітин нейроепітелію у вигляді пікнозу ядер і може вважатися субтоксичною. Присутність у таких культурах дисоційованої ЕНТ значно послаблює цитотоксичний ефект гентаміцину, що підтверджувалося наявністю збережених ділянок епітеліального шару експлантатів.
Результати проведених експериментальних досліджень підтвердили, що ЕНТ зменшує токсичний ефект дії антибіотика на сенсоневральний епітелій внутрішнього вуха щурів в умовах культивування. 
Таким чином, можна припустити, що ЕНТ має протекторний вплив на метаболічні процеси в нейроепітелії внутрішнього вуха і стимулює компенсаторно-відновлювальні процеси (синтез білка, РНК, ДНК та ін.) у пошкоджених волоскових та підтримуючих клітинах. 
Отримані дані дають підставу сподіватися на можливість ефективного використання ЕНТ або препаратів з неї з метою забезпечення її протекторної дії в комплексі лікувальних заходів у хворих на сенсоневральну приглухуватість. Однак необхідна умова успішного клінічного застосування ЕНТ при сенсоневральній приглухуватості – розробка критеріїв відбору хворих до трансплантації з урахуванням зворотності та глибини патологічних змін у сенсоневральному епітелії внутрішнього вуха. У пацієнтів із кохлеовестибулярними розладами ступінь зворотності цих змін можна визначити тільки на основі детального вивчення функціонального стану слухового та вестибулярного аналізаторів, тобто даних аудіометрії та вестибулометрії.

Морально-етичні та правові проблеми трансплантації ЕНТ
Робота з ембріональною тканиною, отриманою внаслідок аборту, пов’язана з питаннями морально-етичного характеру. 
Для їх вирішення розроблені правові положення, які неодноразово обговорювалися на багатьох конгресах та симпозіумах у різних країнах світу. Було створено Європейське товариство трансплантації і регенерації (Nectar), що сконцентрувало зусилля на розвитку ефективних, надійних, безпечних і етично прийнятних методів лікування шляхом трансплантації при нейродегенеративних захворюваннях. В 1994 р. опубліковано «Основні етичні принципи використання людської ембріональної тканини для експериментальних досліджень та клінічної нейротрансплантації». Вони складаються з серії обмежень, мета яких – запобігання застосуванню трансплантатів від договірних абортів, а також дотримання високих стандартів людської гідності та поваги до життя: аборт у жодному разі не має бути зумовлений потребою у трансплантації ембріональної тканини; прийняття рішення щодо проведення абортів не повинно залежати від існування можливості потенційного використання тканин плода для трансплантації; донорство ембріональної тканини не повинно компенсуватися грошовою винагородою [21]. 
У 2000 р. в Україні було прийнято Закон «Про трансплантацію органів та тканин», де в статті 3 розділу 3 регламентується використання ембріональних тканин. У відділенні відновної нейрохірургії Інституту нейрохірургії АМН України (керівник – член-кореспондент АМН України, професор В.І. Цимбалюк), де проведено найбільшу кількість операцій із застосуванням ЕНТ, в 1997 р. були прийняті положення, які регламентують проведення трансплантації ЕНТ у клініці відповідно до міжнародних та внутрішніх правил. Це наступні положення.
1. Трансплантацію ЕНТ потрібно проводити тільки у високоспеціалізованих нейрохірургічних закладах, де є підготовлені кваліфіковані спеціалісти. На проведення операції необхідний дозвіл Вченої ради, погодження з МОЗ України та Комітетом з біомедичної етики.
2. Ембріональна тканина може бути отримана в результаті викидня або після аборту.
3. Рішення про проведення аборту приймає сама жінка.
4. Члени трансплантаційної групи не повинні контактувати з вагітною, щоб не впливати на її рішення про аборт.
5. Аборт повинен проводити лікар-гінеколог.
6. Жінка, яка вирішила робити аборт, повинна бути поінформована про те, що в подальшому її ембріональна тканина буде використана з медичною метою.
7. Жінка повинна дати добровільну письмову згоду на використання ембріональної тканини для медичних цілей.
8. Жінка-донор ембріональної тканини не повинна знати, кому потрібна тканина, що виключає комерційний аспект.
9. Забороняється виплата нагороди за донорську ембріональну тканину.
10. Категорично забороняється цілеспрямоване виношування донором плода для можливого подальшого використання його в дослідженнях та клінічній практиці.
11. Для трансплантації використовується тканина тільки після відділення плода від матері, тобто тканина мертвого плода.
12. Після аборту та констатації смерті плода лікар-гінеколог передає нервову тканину членам групи трансплантологів.
13. З метою попередження можливого інфікування реципієнтів потенційні донори повинні бути здорові, їх необхідно обстежити на RW і вірусоносійство (СНІД, австралійський антиген тощо).
14. Проводять аналогічне лабораторне обстеження отриманої ембріональної тканини.
15. Перед трансплантацією необхідне проведення контролю ембріональної тканини на стерильність.
16. Тільки після отримання негативних аналізів на RW, вірусоносійство та бактеріальне забруднення ембріональна тканина може бути використана для нейротрансплантації.
17. Реципієнт повинен бути поінформований щодо деталей операції трансплантації ембріональної тканини та підтвердити свою згоду письмово.
18. Якщо реципієнт – дитина, таку письмову згоду дають його батьки.
Важливо, щоб отримана від ембріона тканина була здоровою, тому необхідним є її контроль на всі види вірусоносійства. Спочатку обстежували лише жінок, та оскільки одержувані дані іноді були недостовірними, останнім часом стали досліджувати тканину ембріона. Після отримання висновку про відсутність вірусоносійства ембріональна тканина повинна пройти перевірку на стерильність, і лише після контролю вона може бути придатною для трансплантації. При цьому деяка втрата ембріональних клітин (до 25 %) компенсується гарантією стерильності, що попереджає можливі післяопераційні ускладнення.
На даний час розроблено технологію використання кріоконсервованої фетальної тканини. Ця технологія дозволяє створювати банки кріоконсервованих тканин, причому відпадає необхідність у терміновому проведенні операції, є достатньо часу для повноцінного доопераційного обстеження ембріональної тканини, можливість вибору тканини як за терміном, так і за кількістю, і, крім того, виключається ряд спірних морально-етичних питань.

Висновки 
Не викликає сумніву, що терапія ембріональними клітинами буде швидко розвиватися одночасно з усією трансплантологією. Проте тільки фундаментальні дослідження в цій галузі спроможні визначити показання та протипоказання до трансплантації ембріональних тканин і клітин. Саме ретельні та обґрунтовані наукові дослідження зможуть встановити межі можливих втручань у внутрішнє середовище людини з урахуванням як близьких, так і віддалених наслідків. 
Результати експериментальних та клінічних досліджень із трансплантації ЕНТ дозволяють зробити припущення, що вона може бути джерелом специфічної трофіки для нейроепітелію внутрішнього вуха та вестибуло-кохлеарного нерву. Ми вважаємо, що експериментальне вивчення впливу ЕНТ та інших речовин з нейротрофічною дією на сенсорний епітелій внутрішнього вуха дозволить відповісти не тільки на питання про доцільність їх клінічного застосування, але й на низку принципових теоретичних питань щодо патогенезу та лікування сенсоневральної приглухуватості. 

Література
1. Брагин А.Г., Виноградова О.С. Гомо- и гетеровидная трансплантация эмбриональной нервной ткани нервной системы // Бюл. эксперим. биол. и медицины. – 1981. – № 10. – С. 486-489. 
2. Викторов И.В., Шунгская В.Е. Руководство по культивированию нервной ткани. – М.: Наука, 1988. – С. 21-37.
3. Винников Я.А., Титова Л.К. Кортиев орган. – Ленинград: Изд. Акад. наук СССР, 1961. – 260 с. 
4. Вітовська О.П. Ефективність застосування ембріональної тканини в лікуванні пігментної дистрофії сітківки: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. – Одеса, 1997. – 18 с.
5. Дідковський В.Л. Вестибулярна дисфункція при нейросенсорній приглухуватості (підходи до діагностики та лікування): Автореф. дис. ... канд. мед. наук. – Київ, 2000. – 18 с. 
6. Жабоедов Г.Д., Вітовська О.П. Применение эмбриональной нервной ткани в лечении больных с заболеваниями сетчатки и зрительного нерва // Тез. доп. дев`ятого з`їзду офтальмологів України. – Одеса, 1996. – С. 366-367. 
7. Зозуля Ю.А. Современные возможности инструментальной диагностики заболеваний центральной нервной системы // Лікування та діагностика. – 1997. – № 1. – С. 8-12.
8. Лосева Е.В., Ермакова И.В., Тарасова Л.Ю. Действие нейротрансплантации на мозг крыс с поврежденной височной корой // Нейрофизиология. – 1990. – Т. 22. – № 5. – С. 586-595. 
9. Магомедов М.М. Использование трансплантации фетальных тканей в оториноларингологии. Анализ состояния проблемы и перспективы развития // Вестник оториноларингологии. – 1998. – № 2. – С.16-23. 
10. Магомедов М.М. Применение фетальных тканей в терапии хронической нейросенсорной тугоухости // Матеріали міжнародної науково-практичної конференціі, присвяченої 75-річчю кафедри та клініки оториноларингології Дніпропетровської медичної академії. – Дніпропетровськ, 1997. – С. 140-141.
11. Митин Ю.В., Цымбалюк В.И., Семенова В.М. и др. Влияние эмбриональной нервной ткани на поврежденный сенсорный эпителий внутреннего уха (экспериментальное исследование) // Матеріали науково-практичної конференції, присвяченої 100-річчю чл.-кор. О.С. Коломійченка. – Київ, 1998. – С. 92-95. 
12. Репин В.С. Медицинская клеточная биология: новые фундаментальные и прикладные исследования // Трансплантация фетальных тканей и клеток человека. – М., 1996. – С. 19-27. 
13. Родионов С.Ю., Пляскин К.П., Пак Н.А., Масычева В.И. Опыт применения биологически активных соединений из фетальных тканей человека в лечении онкологических заболеваний // Трансплантация фетальных тканей и клеток человека. – М., 1996. – С. 90-92. 
14. Цимбалюк В.І. Трансплантація ембріональної мозкової тканини в комплексному лікуванні дитячого церебрального паралічу // Бюлетень УАН. – 1995. – Вип. 1. – С. 23-24.
15. Цымбалюк В.И. Нейротрансплантация как модель медицины будущего: морально-этические проблемы // Мистецтво лікування. – 2005. – № 5. – С. 23-26.
16. Baird R.A. and Torres M.A. Hair cell regenaration in vestibular otolith organs following aminoglicoside toxicity. Hear Res. 65, 1993, p. 2502-2512 
17. Bjorklund A., Stenevi U. Intracerebral neural implants: neural replacement and reconstruction of damaged circuities // Ann Rev Neurosci. – 1984. – Vol. 7. – P. 279-308. 
18. Das G.D. Development of neocortical transplants // Neural Grafting in the Mammalian CNS / ED.A. Bjoklund, U.Stenevi. Amsterdam: Elsevier. – 1985. – P. 101-123. 
19. Freed C.R., Breeze R.E., Rosenberg N.L. Therapeutic effect of human fetal dopamine cells transplanted in patient with Parkinson`s disease // Abstract`s of Cambridge symposium. Cambridge. – 1989. – P. 64. 
20. Hitchcock E.R., Kenny B.I., Skirboll l. et al. Stereotactic implantation of foetal mesencephalon // Abstract`s of Cambridge symposium. Cambridge. – 1989. – P. 64. 
21. Hoffer B.J., Olson L. Ethical issues in brain-cell transplatation. TINS, 14 (8), 1991, p. 384-388. 
22. Katayama A., Corvin J.T. Cell production in chicken cochlea. J Comp Neurol. 281, 1989, p. 129-135. 
23. Lindvall O., Rehncroma S., Brudin P. Neural transplantation in Parkinson`s disease: the Swedish experience // Abstract’s of Cambridge symposium. Cambridge. – 1989. – P. 63. 
24. Matz G.J. Aminoglycoside ototoxity // Amer J Otolaryngol. – 1986. – Vol. 7. – № 2. – P. 117-119.
25. Rhim J., Sandgren E., Brinster R. The studied of rat`s hepatocytes transplantated into the mouse. Proc Nat Acad Sci, 92: 4942-4946, 1995. 
26. Rubel E., Dew L.A., Roberson D.W. Mammalian vestibular hair cell regeneration // Science. – 1995. – Vol. 267. – P. 701-703.