Автоімунні ускладнення гемофілії: наявні та очікувані форми
сторінки: 17-20
Гемофілія – захворювання, зумовлене успадкованою або набутою функціональною нестачею окремих факторів системи згортання крові. Як правило, подібний дефіцит є наслідком генетично зумовлених молекулярних аномалій в будові певних факторів системи згортання крові, що призводить до їх функціональної недостатності з вкрай тяжкими наслідками у вигляді рясних кровотеч. Водночас характерною рисою останнього десятиліття є поширення автоімунних ускладнень цього захворювання, причому дедалі частіше спостерігають автоімунно ускладнені форми набутої гемофілії. Пропонована робота є спробою узагальнити відомості про подібні форми гемофілії, розглянути молекулярні механізми її виникнення та розвитку, оцінити патологічні чинники, наявні й очікувані чинники ризику.
Система згортання крові є багатоланковим каскадом ферментативних процесів, що полягає в послідовній активації групи профакторів системи (рис. 1). Кожен з проактивованих факторів системи є активатором наступного фактора. Наприкінці активаційного каскаду відбувається перетворення фактора ІІ (протромбін) на активний тромбін (фактор ІІа), який забезпечує перетворення розчинного фібриногену на схильний до латеральної асоціації фібрин та активацію профактора ХІІІ до активної трансглутамінази ХІІІа. Остання відповідає за формування поперечних ковалентних зшивок у фібриновому згустку, що утворився [1].
Нестача або функціональна недостатність будь-якого з компонентів такого роду каскадів зумовлює недостатню ефективність системи в цілому. Саме до таких порушень і належить гемофілія. Коли говорять про гемофілію, як правило, мають на увазі спадкові її форми, спричинені дефіцитом VIII чи IX факторів згортання крові (гемофілія А та В відповідно). Частка гемофілії А становить 87-94% у загальній структурі захворювання, тоді як гемофілія В поширена значно менше – 6-13% випадків. Подібний розподіл навряд чи є випадковим, оскільки чітко корелює з молекулярною масою VIII та IX факторів – 330 і 57 кДа відповідно.
| Тобто збільшення розміру молекули білка зумовлює підвищення ймовірності патогенної мутації та подальшого утворення функціонально неповноцінного білка. |
Згідно з класифікацією ВООЗ, залежно від рівня функціональної недостатності факторів згортання крові розрізняють три ступеня тяжкості гемофілії:
• тяжкий, за якого рівень факторів VIII чи IX становить <1% від норми;
• помірний – 1-4% від норми;
• легкий – 5-25% від норми.
Унаслідок Х-зчепленого характеру успадкування дефіцит відповідних факторів, а отже і виникнення захворювання, спостерігають лише в осіб чоловічої статі, тоді як жінки можуть бути лише носіями відповідного гена. Поширеність захворювання в більшості країн Європи становить 15-20 випадків на 100 тис., або, згідно з даними ВООЗ, 1:5 000-1:10 000 новонароджених хлопчиків. Загалом у світі – близько 137 000 хворих на гемофілію [2].
Єдиний метод лікування та профілактики кровотеч, зумовлених гемофілією, полягає в заміщенні дефіцитного фактора згортання крові відповідним препаратом плазмового чи рекомбінантного походження.
Розрізняють три покоління препаратів рекомбінантного походження залежно від походження та часу впровадження:
• до препаратів І покоління належать свіжозаморожена донорська плазма та кріопреципітат. Їх застосування пов’язане з низкою ускладнень, зумовлених об’ємним перевантаженням, пірогенними та алергійними реакціями;
• препарати ІІ покоління – ліофілізовані концентрати низького та проміжного рівнів очищення – дали змогу подолати ці ускладнення, однак вони можуть спричинювати такі побічні реакції, як тромбози та гемоліз;
• до препаратів ІІІ покоління належать високоочищені білки плазми, а також рекомбінантні білки. Вони певною мірою дали змогу уникнути проблем, притаманних першим двом групам препаратів, однак на передній план вийшли ускладнення, зумовлені формуванням інгібітора та ризиком передачі патогенних вірусів.
Тобто препаратам усіх трьох поколінь притаманні певні недоліки та обмеження щодо застосування. Через це в клінічному обігу перебувають три групи концентратів факторів згортання крові, а саме: проміжного, високого (в тому числі й моноклональні очищені) та дуже високого ступеня очищення (як плазмові, так і рекомбінантні).
Терапевтичне застосування препаратів на основі кріопреципітату, що містить VIII фактор, розпочалося ще в середині 60-х років ХХ ст., останні ж 25-30 років відбувається інтенсивне впровадження препаратів ІІ та ІІІ покоління. Це передусім зумовлено ризиком передачі вірусних захворювань, зокрема ятрогенною пандемією СНІДу серед хворих на гемофілію і членів їх сімей, яку спостерігали в середині 80-х років [2]. І хоча розроблені методики очищення відповідних факторів дали змогу максимально знизити ризик передачі інфекції, однак для препаратів донорського походження абсолютна вірусна безпечність лишається практично недосяжною. Тому за рівнями вірусної безпечності препарати умовно поділяють на невірусінактивовані, вірусінактивовані та рекомбінантні.
| Навіть за найвищого ступеня очищення замісні препарати зумовлюють реакцію гіперчутливості та виявляють імуномодулювальні властивості, причому найбільш імуногенними виявилися вірусбезпечні рекомбінантні білки. |
| Водночас впровадження в клінічну практику білкових препаратів – замісників дефіцитних факторів – призвело до появи автоімунних ускладнень гемофілії, зумовлених формуванням імунної відповіді на препарати замісної терапії, так званого розвитку інгібітора. |
Тобто для білкових препаратів для внутрішньосудинного застосування поняття чистоти та безпечності не є синонімами, оскільки на передній план виходить збереження нативної структури (конформації) білків, у випадку факторів VIIІ та IX – досить великих і лабільних. І коли в більшості препаратів для діагностики наявність денатурованої домішки може бути компенсована введенням у розрахунки відповідного коефіцієнту, то для препаратів, призначених для замісної терапії, наявність денатурованих домішок створює низку проблем, пов’язаних із формуванням автоімунних реакцій на власний, і без того дефіцитний білок. Частота їх формування залежить як від типу гемофілії, так і від ступеня тяжкості захворювання. Вони досить поширені серед хворих на гемофілію А (10-46%), головним чином за тяжкої форми (21-52%), і значно рідше – за помірної та легкої форм (5,3-12,5%). Для гемофілії В вони менш характерні (3-5% хворих на тяжку гемофілію) [3]. Тобто спостерігають виражену кореляцію між розмірами молекули відповідного фактора, ймовірністю формування тією чи іншою мірою денатурованого білка, частотними та кількісними показниками необхідності компенсації дефіциту факторів введенням замісних препаратів. Розвиток імунної реакції призводить до формування резистентності до замісних препаратів, що є однією з найтяжчих та все ще невирішених проблем гемофілії. Методи профілактики утворення інгібітора лишаються маловивченими, забезпечення ж гемостазу у хворого з подібним захворюванням стає складним і небезпечним для життя завданням, особливо в разі хірургічного втручання [4, 5].
Аналіз наявних даних дає змогу систематизувати позагенетичні чинники, що призводять до розвитку інгібітора, пояснити відомі шляхи формування автоімунної реакції на власні білки згортання крові, обговорити чинники ризику, які можуть значно погіршити стан проблеми в цілому.
В основі розвитку імунної реакції – розпізнавання імунною системою того чи іншого білка як чужорідного, структура якого не відповідає такій білків певного організму [6]. При цьому байдуже, чи є такий білок дійсно чужорідним, чи з певних причин на його поверхні з’явилися структурні угруповання, що не відповідать прийнятим у цій системі, така собі «чорна мітка». Подібний механізм є однією з основних складових системи захисту організму [7].
| Водночас, за певних умов, розвиток і поглиблення імунної відповіді на власні денатуровані білки можуть призвести до формування автоімунної реакції на ці самі білки в нативній конформації. |
| Класичним прикладом таких ускладнень є давно відомі так звані симпатичні захворювання парних органів, за яких розвиток імунної відповіді на ушкоджені білки одного з парних органів призводить до автоімунних уражень цілком здорового парного органа [8]. |
Що ж зумовлює появу в організмі білків, які імунна система сприймає як «чужі»? Передусім певною мірою денатуровані форми утворюються внsаслідок протеолітичних ушкоджень. Протеолітичні ферменти відіграють важливу роль у забезпеченні регуляції багатьох фізіологічних і патофізіологічних процесів, зокрема за обмеженого протеолізу неактивні білкові попередники (профактори, проферменти тощо) перетворюються на активні форми. Саме таким протеолітичним шляхом активується більшість компонентів систем згортання крові та фібринолізу. Процеси протеолітичної активації перебувають під контролем різноманітних за механізмом дії складних систем регуляції та виявляють чітко спрямований вплив. Однак за низки захворювань, передусім запальних і онкологічних, відбувається надмірна активація протеолітичних ферментів, свого роду «протеолітичний спалах», зумовлений дисбалансом між процесами активації та здатністю систем регуляції обмежити надмірну активність протеїназ [9]. Внаслідок такого надмірного функціонально незумовленого протеолізу утворюються білкові форми, що зазнали додаткових розщеплень у поліпептидному ланцюгу з відповідною зміною поверхні білка. Серед таких похідних найвідомішими є ангіостатини, що являють собою групу фрагментів плазміногену з виявленою антиметастатичною дією [10]. Зрозуміло, що утворені внаслідок надмірного протеолізу тією чи іншою мірою денатуровані фрагменти білків не можуть не зумовлювати низку автоімунних порушень, що можна пояснити як імунною відповіддю на денатуровані білки, так і поширенням імунної відповіді на неушкоджені форми.
Не менш ефективний шлях утворення інгібітора зумовлений формуванням структурно хибних білків, що з тих чи інших причин не набули єдино правильної конформації. Як відомо, формування функціонально активної структури білків є складним багатостадійним процесом, що відбувається за взаємодії утворюваної молекули з шапероновими компонентами фолдингової системи клітини. Порушення нормального функціонування цієї системи призводить до місфолдингу – формування більш-менш виражених хибних конформаційних структур генетично правильних білків [11].
| Зокрема одна з ключових причин формування інгібіторної форми гемофілії спричинена вірусним ушкодженням печінки – органа, що забезпечує біосинтез більшості компонентів системи гемостазу. Порушення нормального перебігу клітинних процесів може бути зумовлене не лише впливом інфекційного агенту, але й побічною дією найрізноманітніших лікарських засобів, що за умов інтенсивного розвитку ринку медпрепаратів загострює наявну медико-соціальну проблему. |
Загальновідомим прикладом індукованого запуску автоімунного патогенезу є системний червоний вовчак (lupus erythematosis) – поліетіологічне захворювання, що може бути спричинене як хронічним вірусним інфікуванням, так і побічними ефектами медикаментозної терапії.
Отже, на відміну від традиційних форм гемофілії, автоімунно ускладнені форми можуть розвиватися не як генетично зумовлені захворювання, а внаслідок численних порушень нормального функціонування організму, причому така форма захворювання не має обмежень за статтю. Незважаючи на актуальність проблеми, наявні відомості про ступінь ризику розвитку інгібітора мають уривчастий характер.
| У разі застосування препаратів низького та проміжного ступенів очищення частота розвитку інгібітора є значно меншою, ніж за використання високоочищених. Цю особливість певною мірою можна пояснити можливою імуносупресивною дією супутніх білків і наявністю компонентів, що стабілізують замісні фактори. Так, вилучення з препаратів, які містять фактор VIII, його нативного стабілізатора – фактора Віллебранда – призводить до зростання частоти утворення інгібітора [13, 14]. Однак підвищення імуногенності препарату та зумовлений нею розвиток інгібітора може бути також наслідком технологічних процесів очищення та вірус-інактивації як наслідок більшої чи меншої денатурації цільового білка. Зазначено, що ризик розвитку інгібітора залежить не лише від типу препаратів, але й від послідовності їх застосування під час лікування. Для пацієнтів, які отримували замісну терапію лише одним плазмовим препаратом, ризик розвитку інгібітора коливався від 0 до 12,4%, у разі застосування кількох плазмових препаратів – зростав до 20,3-33% і досягав 36-38,7% у разі використання рекомбінантних препаратів [15]. |
| Тому можна з впевненістю говорити про підвищену імуногенність саме рекомбінантних препаратів. |
У цьому немає нічого несподіваного, оскільки структуроутворення рекомбінантних білків відбувається в еволюційно чужорідній для них клітинній системі, шаперонові компоненти якої формують білкову молекулу за структурними правилами, що значно відрізняються від притаманних людському організму. Зазвичай подібне структуроутворення завершується формуванням так званих тілець включення – білкових агрегатів на основі генетично правильних, однак позбавлених функціональної активності через денатурований стан молекул цільового білка. Технологічне відновлення функціональної активності такого продукту (рефолдинг) визнають успішним навіть за реактивації близько 10% білка [16], однак питання про імунологічну сумісність подібних препаратів лишається відкритим.
Не варто забувати і про схильність білкових препаратів до денатурації протягом численних технологічних процедур виділення та зберігання [17]. За будь-якої причини формування імунної відповіді на введені препарати не лише зменшує ефективність їх терапевтичної дії, але й зумовлює можливість розвитку непередбачуваних автоімунних, алергійних та анафілактичних наслідків [18, 19].
У контексті наведеного певне занепокоєння викликають можливі наслідки впровадження антикоагулянтних препаратів на основі мутованих форм рекомбінантного S-тромбіну. Тромбін (К.Ф. 3.4.21.5) є поліфункціональним ферментом, що бере участь у регуляції найрізноманітніших фізіологічних процесів, причому в системі гемостазу він виконує як прокоагулянтні, так і антикоагулянтні функції. Останніми роками дедалі ширше обговорюють можливості розділення цих функцій методами спрямованого мутагенезу для отримання форм тромбіну з антикоагулянтною дією та відповідних препаратів на його основі [20]. Подібно до більшості білків, молекула тромбіну перебуває в стані динамічної рівноваги між різними структурними формами. Відома так звана fast-форма тромбіну, що виконує прокоагулянтні функції, опосередковуючи вибіркові розщеплення в молекулі фібриногену, тоді як slow-форма ефективно активує протеїн С, завдяки чому має антикоагуляційну дію. Рівновага між fast- та slow-формами тромбіну залежить від низки фізико-хімічних чинників, передусім – від концентрації йонів натрію, що забезпечують зсув рівноваги в бік fast-форми (рис. 2) [21]. Подібний вплив зумовлений наявністю в молекулі тромбіну натрійзв’язувальної ділянки, що за фізіологічних концентрацій йонів натрію забезпечує молекулярне співвідношення між fast- та slow-формами на рівні 3:2 [22]. Розвиток генної інженерії дає змогу впровадити вибіркову заміну окремих амінокислот у первинній структурі рекомбінантних білків, завдяки чому досягають вибіркової інактивації тих чи інших структурних угруповань внаслідок порушення окремих внутрішньомолекулярних зв’язків. Тому заміна певних аніонних амінокислотних залишків натрійзв’язувальної ділянки тромбіну забезпечує формування молекулярної структури з різким зсувом в бік slow-форми та утворення фермента з вираженими антикоагулянтними властивостями. Саме до таких похідних належать мутантні форми D189A, D189N, W215A/E217A, E217K тощо [20]. Доведено ефективність подібних похідних як антикоагулянтів у дослідах на тваринах in vivo. Враховуючи розміри задіяних в опрацюванні цієї теми робіт та актуальність створення антитромботичних препаратів загалом, поява відповідних препаратів медичного призначення видається справою найближчого часу. Однак не менш ймовірним є формування автоімунної реакції на подібні препарати – як внаслідок притаманної продуктам генної інженерії наявності денатурованих домішок, так і через власну імуногенність мутованих форм тромбіну. Як і розвиток інгібіторних форм гемофілії, формування імунної відповіді залежатиме від індивідуального рівня сенсибілізації, забезпечуючи формування нової автоімунної протромбін- чи тромбіндефіцитної форми гемофілії у певної частини пацієнтів, що отримуватимуть лікування новим антикоагулянтом.
Наведені міркування не заперечують доцільності клінічного застосування рекомбінантних білків загалом, проте свідчать про існування низки як генетично обумовлених, так і набутих, ятрогенних чинників ризику розвитку інгібіторної форми гемофілії. Це, своєю чергою, змушує підняти питання про необхідність забезпечення функціональної сумісності структуроутворювальних систем клітин – продуцентів рекомбінантних білків – з імунною системою людини.
Література
1. Молекулярные основы свертывания крови: Волков Г.Л., Платонова Т.Н., Савчук А.Н., и др. Современные представления о системе гемостаза. – К.: Наук. думка, 2005. – С. 85-140.
2. Стасишин О.В., Логінський В.Є., Новак В.Л. Поширеність інфікування хворих на гемофілію гемотрансмісивними вірусами // Український журнал гематології та трансфузіології. – 2008. – № 1 (8). – С. 17-20.
3. Стасишин А.В. Гемофилия, осложненная ингибитором: Молекулярная патология белка / Под ред. Д.И. Заболотного. – К.: Логос, 2008. – С. 55-73.
4. Стасишин О.В. Вплив замісної трансфузійної терапії на імунний статус хворих на гемофілію, ускладнену інгібітором // Укр. хіміотерапевтич. журн. – 2008. – № 1-2. – C. 291-295.
5. Стасишин О.В. Ревматоїдний фактор та артропатії у хворих на гемофілію, ускладнену інгібітором // Український журнал гематології та трансфузіології. – 2008. – № 6 (8) – С. 21-23.
6. Verevka S.V. Formation and recognition of superficial microclusters as the integral part of processing of proteins: Protein Research Progress (Boscoe A.B. and Listow C.W., Eds.) – NY; Nova Science Publishers, 2008. – P. 9-15.
7. Заболотный Д.И., Веревка С.В. Межмолекулярная координация белков в норме и при патологии: Молекулярная патология белка / Под ред. Д.И. Заболотного. – К.: Логос, 2008. – С. 9-31.
8. Чернушенко Е.Ф. Аутоиммунизация и ее значение в клинике // Мистецтво лікування. – 2007. – № 5. – С. 53-57.
9. Веремеенко К.Н., Заболотный Д.И. Роль протеолиза в инвазии и метастазировании злокачественных опухолей // Журнал Академії медичних наук України. – 2002. – Т. 8, № 2. – С. 217-237.
10. Doll J.A., Soff G.A. Angiostatin. Generation, Structure and Function of the Isoforms // Cancer Treat. Res. – 2005. – Vol. 126. – P. 175-204.
11. Марченко Н.Ю., Гарбузинский С.А., Семисотнов Г.В. Молекулярные шапероны в норме и при патологии: Молекулярная патология белка / Под ред. Д.И. Заболотного. – К.: Логос, 2008. – С. 74-97.
12. Заболотний Д.І., Алєксєєнко І.Р. Епідемії ХХІ сторіччя: молекулярна етіологія // Вісник НАН України. – 2010. – № 1. – С. 29-37.
13. Saint-Remy J-M.R., Lacroix-Desmazes S., Oldenburg J. Inhibitors in haemophilia: pathophysiology // Haemophilia. – 2004. – Vol. 10 (Suppl. 4). – P. 146-151.
14. Astermark J. Why do inhibitor develop? Principles and factors influencing the risk for inhibitor development in haemophilia // Haemophilia. – 2006. – Vol. 12 (Suppl. 3). – P. 52-60.
15. White G.C., Kempton C.L., Grismey A., et al. Cellular immune responses in hemophilia: why do inhibitor develop in some, but not all hemophiliacs // J. Thromb. Haemost. – 2005. – Vol. 3, № 8. – P. 1676-1681.
16. Маркосян А.К., Курганов Б.И. Фолдинг, неправильный фолдинг и агрегация белков. Образование телец включения и агресом // Биохимия. – 2004. – Т. 69, № 9. – С. 1196-1212.
17. Шевель М.В., Веревка С.В. Автоповреждения белковых препаратов: молекулярные механизмы и пути предотвращения // Современные проблемы токсикологии. – 2006. – № 3. – С. 41-45.
18. Schellekens S., Casadevall N. Immunogenicity of recombinant human proteins: causes and consequences // J. Neurol. – 2004. – Vol. 251 (Suppl. 2.II). – P. 4-9.
19. Maclennan S., Barbara J. Risks and side effects of therapy with plasma and plasma fractions // Best. Pract. Res. Clin. Haematol. – 2006. – Vol. 19, № 1. – P. 169-189.
20. Колодзейская М.В., Грищук В.И., Чернышенко Т.М. и др. Рекомбинантная антикоагулянтная форма α-тромбина человека // Біотехнологія. – 2009. – Т. 2, № 3. – С. 9-22.
21. Dang O.D., Vindigni A., and Di Cera E. An allosteric switch controls the procoagulant and anticoagulant activities of thrombin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1995. – Vol. 92, № 13. – Р. 5977-5981.
22. Колодзейская М.В., Волков Г.Л. Ионы натрия как эффектор каталитического действия α-тромбина // Укр. біохім. журн. – 2007. – Т. 79, № 1. – С. 5-21.
