сховати меню

Оцінка нового мультиплексного аналізу для діагностики алергії

сторінки: 40-43

Buzzulini Francesca1, Da Re Mirella1, Scala Enrico3, Martelli Paola1, Conte Mariaelisabetta1, Brusca Ignazio2, Villalta Danilo1. 1Allergy and Immunology Unit, Santa Maria degli Angeli Hospital, Pordenone, Italy. 2Laboratory Medicine Unity of Buccheri, la Ferla Hospital, Palermo, Italy. 3IDI–IRCCS Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Rome, Italy

За останні роки в алергології відбулись, без перебільшення, революційні зрушення, вони стосуються насамперед нових методів діагностики, а саме молекулярної алергодіагностики, яка стрімко увійшла в повсякденну практику лікаря-алерголога, змінюючи парадигму розуміння причини розвитку тої чи тої алергічної патологіі і надаючи більш таргетні дані щодо лікувальних та елімінаційних заходів. Водночас відбувається певна еволюція самих методів молекулярної алергодіагностики, щороку відкривають нові молекули алергенів, які з часом з’являються в оновлюваних системах діагностики.Багатокомпонентний тест-аналізатор нового покоління ALEX (Allergy Explorer) з’явився на ринку відносно нещодавно, але вже встиг здобути прихильність як практикуючих лікарів, так і науковців світового рівня. Велика кількість досліджень ALEX була зроблена в Україні і на загал вже представлені перші результати щодо ефективності, специфічності та чутливості методу. Як будь-який новий метод у медицині, ALEX-тест активно вивчається, й доказова база щодо нього тільки накопичується, але має велике значення, щоб дослідження були якісними, виконані авторитетними вченими й опубліковані в авторитетних наукових виданнях. Пропонуємо до вашої уваги переклад одного з таких досліджень, яке вийшло у 2019 р. в рамках журналу Clinica Chimica Acta видавничої компанії Elsevier.

На сучасному етапі молекулярна алергодіагностика (МАД) значно покращила якість діагностики алергії, надаючи можливість відрізняти справжню сенсибілізацію від перехресних реакцій, з важливим каскадом даних щодо вибору причинно-значущих алергенів для проведення алерген-специфічної імунотерапії, а також прогнозу ризику розвитку серйозних алергічних реакцій у разі харчової алергії [1, 2]. Проте, щоб повністю реалізувати цей потенціал, він має бути імплементований в рамках чіткої діагностичної платформи і заснований на достатньому рівні знань методів діагностики.

На сьогодні тестування МАД може проводитися за допомогою моно- або мультиплексного аналізу. Дотепер моноплексні аналізи були методом вибору в разі традиційного підходу до діагностики – «зверху вниз», це перший етап (перший рівень) діагностики алергії, в рамках якого лікар-алерголог, переходячи від історії хвороби, фізикальних даних до шкірного прик-тесту (ШПТ)/або визначення рівня IgE до екстрактів, обирає, які молекули мають бути протестовані, грунтуючись на даних анамнезу. Моноплексні системи МАД видають кількісний результат, є високоавтоматизованими (з можливістю дозування як екстрактів, так і молекул), економічно ефективними, якщо їх проводити за надійним діагностичним алгоритмом. З іншого боку, деякі види сенсибілізації можуть бути пропущені або недооцінені.

Мультиплексний аналіз, зі свого боку, пропонує ширше бачення профілю сенсибілізації пацієнта. Він застосовується, коли необхідно протестувати > 12–13 молекул (з клінічними та економічними перевагами) або в педіатричній категорії пацієнтів через невелику кількість необхідної сироватки. Мультиплексні системи є методом вибору в разі підходу «знизу вгору» – для тих клініцистів, які вирішують перейти від широкого лабораторного тестування до клінічного, а також у всіх тих клінічних випадках, які потребують після першого підходу «зверху вниз» розширити панель тестованих молекул («U-подібний підхід») [3].

Однак доступні мультиплексні аналізи є напівкількісними й менш чутливими, ніж моноплексні. Перший доступний на ринку мультиплексний аналіз, що його використовують в даний час, є мікрочіп (ISAC®, Thermo Fisher, Швеція), який дає змогу тестувати 112 різних молекул, як рекомбінантних, так і нативних, з невеликою кількістю сироватки (30 мкл) [4, 5].

Нещодавно був розроблений ще один макрочіп (Allergy Explorer-ALEX®, Macro-ArrayDX Відень, Австрія). Він містить 157 екстрактів алергенів і 125 молекулярних компонентів і, напевне, має найширший нині набір алергенів. Крім того, основний аналіз IgE до екстрактів алергенів у одному тесті дає змогу оцінити рівень IgE до відповідних специфічних і перехресно-реактивних компонентів. Нарешті, пригнічення перехресно-реактивних вуглеводних детермінант (cross-reactive carbohydrate determinants, CCD) додатково покращує специфічність IgE-аналізу.

Метою даного дослідження було представити аналітичні дані щодо ефективності нового методу алергодіагностики ALEX® в обраній популяції, порівнюючи його з ImmunoCAP® (Термо Фішер, Швеція). Два методи порівнювали на якісному та кількісному рівні. Також порівнювали кожен окремий метод з ШПТ з точки зору якісних результатів.

Матеріали та методи дослідження

вгору

Загалом було проведено тестування 120 сироваток, отриманих з двох центрів в Італії. Середній вік досліджуваної популяції становив 29 років (від 3 до 69): 58 чоловіків і 62 жінки. В даній популяції 56 пацієнтів страждали на респіраторну алергію і 49 – на харчову. У підгрупі респіраторної алергії в 48 осіб було виявлено риніт: у 6 – легкий інтермітуючий (12%), 2 – легкий персистуючий (4%), 5 – середньотяжкий інтермітуючий (10%) і в 35 – середньої тяжкості персистуючий (70%). 14 пацієнтів страждали на алергічну астму. В популяції харчової алергії – 30 осіб з LTP-синдромом: 5 (16,7%) – з легкими симптомами, 17 (56,6%) – з помірними і 8 (26,7%) – з тяжкими симптомами, а також 19 – з алергією на волоський горіх/фундук: 5 (26,3%) пацієнтів – з легкими симптомами, 12 (63,1%) – з помірними і 2 (10,6%) – з тяжкими.

Сироватки досліджували за допомогою ALEX®, і результати порівнювали з даними, отриманими в моноплексному IgE-тесті ImmunoCAP® та ШПТ (ALK Abello для персика і Stallergens для всіх інших екст­рактів), що проводилися раніше за клінічними показаннями відповідно до традиційних методів діагностики «зверху вниз». Рішення порівняти ALEX® з ImmunoCAP® виникло через необхідність поглянути на ефективність ALEX® як з точки зору якісних і кількісних результатів, так і для оцінки діагностики екст­рактів і молекул.

У ALEX® різні алергени й компоненти наносять на нітроцелюлозну мембрану в чіпі картриджа, який потім інкубують з 0,5 мл 1:5 розведення сироватки при перемішуванні. Примітно, що сироватковий розчинник містить інгібітор CCD; дотримуючись цієї процедури без додаткової попередньої інкубації, виробник гарантує інгібування CCD на рівні 85%. Після двогодинної інкубації чіпи ретельно промивають, додають попередньо приготоване розведення людського IgE, міченого лужною фосфатазою, і інкубують упродовж 30 хв. Після чергового циклу інтенсивної промивки додають ферментний субстрат, і через 8 хв реакція завершується. Мембрани сушать, і інтенсивність колірної реакції для кожної плями алергену вимірюють за допомогою пари заряджених пристроїв камери.

Спеціальне програмне забезпечення оцифровує зображення і готує звіт, в якому перераховані алергени і компоненти, а також їхня оцінка в kUA/ml. Також вимірюється рівень загального IgE. Нарешті, виходить довільна калібрувальна крива внаслідок взаємодії чотирьох плям зі зменшенням концентрації специфічного IgE, що відповідає < 0,35 kUA/L, 0,35–1 kUA/L, 1–5 kUA/L, 5–15 kUA/L і > 15 kUA/L [6]. Ми вважали позитивною концентрацію ≥ 0,35 kUA/L як для ImmunoCAP®, так і для ALEX®.

Результати та їх обговорення

вгору

Наше дослідження вивчало ефективність нового мультиплексного аналізу ALEX® для виявлення антитіл IgE до пилку, пилових кліщів, екстрактів і молекул харчових алергенів. Було проведено якісний і кількісний аналіз з порівнянням ALEX® з моноплексним тестом ImmunoCAP®.

Аналіз екстрактів і молекул пилку

Аналіз екстрактів пилку показав істотну відповідність зі значенням k > 0,81 в 3/10 екстрактів; найменша відповідність спостерігалась щодо кипарису (k = 0), полину (k = 0,26) і амброзії (k = 0,16). Було виявлено, що ImmunoCAP® часто є позитивним, тоді як ALEX® лишається негативним. Щоб вивчити клінічну значимість таких результатів, ми проаналізували клінічні дані. У полісенсибілізованих пацієнтів ідентифікація клінічно значущого алергену часто є складним завданням, проте в досліджуваній популяції пацієнти використовували монітор алергії App для повідомлення про свої симптоми, що дає можливість зіставити оцінки симптомів з кількістю пилку. Аналіз, проведений для амброзії та кипарису, двох алергенів з суттєвими розбіжностями, виявив клінічну значимість результатів ImmunoCAP® у 3/12 (25%) пацієнтів для амброзії і 3/14 (21,4%) – для кипарису.

При порівнянні результатів, отриманих для IgE безпосередньо з молекулярними компонентами, загальна відповідність була майже ідеальною (k = 0,92), причому найнижча ефективність спостерігалась для Amb a 1 (основний детермінант амброзії).

Для всіх інших молекул результати демонструють хорошу відповідність між різними молекулами (k в діапазоні від 0,87 до 1). Молекулярний компонент пилку кипарису (Cup a 1) і молекулярний компонент полину (Artv 1) показали майже ідеальну відповідність, що дає змогу ідентифікувати пацієнтів, сенсибілізованих до кипарису й полину, що їх було «пропущено» під час визначення екстракту.

В результаті комбінованого аналізу екстрактів і молекулярних компонентів ми виявили деякі невідповідності. Всебічний аналіз виявив, що в 3 випадках (2 для полину і 1 для екстракту оливи) наявність CCD могла призвести до хибнопозитивних результатів в екстрактах ImmunoCAP®, тому під час тестування екстрактів пилку ImmunoCAP® часто є позитивним, тоді як ALEX® лишається негативним. У двох пацієнтів аналіз показав відсутність кореляції між визначенням екстракту амброзії та її молекулярного компонента. Так, амброзія і Amb a 1 був позитивний в ImmunoCAP® і негативний в ALEX®; не можна виключати, що в цих випадках CCD може зіграти свою роль, оскільки Amb a 1 є нативним в ImmunoCAP® і рекомбінантним в ALEX®.

Крім того, за даними Hemmer і співавт., целюлоза, яка використовується як носій твердої фази алергену в ImmunoCAP®, містить різну кількість CCD, достатню для того, щоб спричинити хибнопозитивні результати тесту з неглікозильованими рекомбінантними алергенами в пацієнтів з високим рівнем антитіл проти CCD IgE.

Аналіз харчових алергенів

В обох популяціях, як і очікувалося, екстракти показали меншу відповідність у порівнянні з молекулами. З точки зору молекулярних компонентів відподність була близькою до ідеальної для Pru p 3 і помірною для Ara h 9; проте в останньому випадку, коли ALEX® показав негативні результати, ImmunoCAP® був позитивним при низьких титрах (<1 кUА/L).

Аналіз, що його було проведено серед популяції, сенсибілізованої до волоського горіха/фундука, продемонстрував майже ідеальну відповідність щодо LTP (Cora 8); серед сімейства запасних білків хороший рівень відповідності спостерігався тільки для Cor a 9 (глобулін 11S), а не для Cor a 14 (альбумін 2S), причому 6 пацієнтів мали негативний результат згідно з ALEX® і позитивний при високих титрах на ImmunoCAP® (> 1 кUА/L) для Cor a 14. Слід підкреслити, що Cor a 14 є нативним в ALEX® і рекомбінантним в ImmunoCAP®. Більша чутливість ImmunoCAP® щодо виявлення алергії на горіхи була недавно продемонстрована також у порівнянні з мультиплексним методом, що використовується нині (ISAC®) [9].

ШПТ проти ImmunoCAP® і ALEX®

Відповідність ImmunoCAP® і ALEX® з ШПТ була відзначена як істотна для обох методів. Варто відзначити, що і ImmunoCAP®, і ALEX® представляють відповідність з ШПТ, яка є далекою від хорошої. В контексті дебатів між шкірним тестуванням і дослідженням in vitro [10, 11] ці дані викликають стурбованість з приводу чутливості та складу ШПТ і їх позиціонування як першого кроку в алгоритмі діагностики. Літературні дані свідчать, що чутливість ШПТ становить 70–95% і специфічність 80–97% для інгаляційних алергенів, що є гарантією підвищення чутливості ШПТ до 97–99%. Ефективність для харчових алергенів нижча з чутливістю і специфічністю 30–90% і 20–60% відповідно в залежності від алергену і типу підходу (екстракт проти прик-тестування) [12, 13].

Однак питання стандартизації мінорних і мажорних алергенних детермінант, сталість складу від партії до партії та інші обмеження методу все ще обумовлюють упередження щодо інтерпретації результатів ШПТ [13–16]. У зв’язку з цим імплементація мультиплексного аналізу (що містить як екстракти, так і молекули) заслуговує, принаймні, серйозного розгляду як методу діагностики першої лінії, зокрема в разі тестування з низьким вмістом алергенів (екстракти для ШПТ) або слабкою стабільністю [11]. Проте під час інтерпретації даних важливо пам’ятати, що, незалежно від методу діагностики, демонстрація паттерну IgE-сенсибілізації є тільки доказом сенсибілізації, і тільки кореляція даних з анамнезом захворювання і клінічними симптомами є важливою.

Висновки

вгору

Дане дослідження, наскільки відомо авторам, є першим повідомленням про пряме порівняння мультиплексного дослідження ALEX® і моноплексного тесту ImmunoCAP®.

Результати дослідження продемонстрували істотну відповідність між цими двома методами з трохи меншою відповідністю щодо виявлення IgE для екстрактів, ніж для молекулярних компонентів, як для інгаляційних, так і для харчових алергенів. ALEX®, виконуючи кількісний аналіз, долає одне з основних обмежень мультиплексних аналізів. Технічні особливості даного методу здатні потенційно знизити витрати в порівнянні з мультиплексними аналізами першого покоління. З точки зору виконання, ALEX® підсилює всі переваги технології мультиплексного аналізу. Він являє собою простий у застосуванні метод з чітким визначенням факторів, які можуть вплинути на остаточний результат. Для тестування АLEX® потрібно лише одне визначення кожного алергену, а не потрійне, як у ISAC®, до того ж результати ImmunoCAP® потребують суттєвого узгодження даних.

Тим не менш, значення ALEX® в рутинних клінічних умовах потребує підтвердження. Зокрема, наступні дослідження мають зосереджуватись на оптимізації деяких реагентів, аналітичної чутливості, а також діагностичної чутливості й специфічності.

Як вже було зазначено, обмеження розміру вибірки могло вплинути на відповідність, особливо під час оцінки одного екстракту/молекулярного компоненту. Крім того, слід мати на увазі, що імунна відповідь людини, опосередкована IgE, є поліклональною і схильною до впливу генетики. Екстракти алергенів можуть бути гетерогенними, їх складно стандартизувати на хорошому молекулярному рівні, і, як підкреслює Мюллер [19], рекомбінантні молекули можуть демонструвати непередбачувану поведінку.

Наявність як екстрактів, так і молекулярних компонентів має полегшувати і, можливо, прискорювати отримання аналітичних показників, однак перш ніж використовувати ALEX® як еталонний метод у підході «знизу вгору», необхідно підтвердити дані в широкому масштабі та інтерпретувати їх у світлі клінічних даних.

У будь-якому випадку, наявність нового мультиплексного тесту, заснованого на достовірних наукових даних, стимулює дослідження в галузі молекулярної алергії.

Список літератури – у редакції.

Реферативний огляд статті BuzzuliniF. et al. «Evaluation of a new multiplex assay for allergy diagnosis», Clinica Chimica Acta 493 (2019), 73–78,

підготували Марія Капустина та Анна Артюх.

Повну версію дивіться на сайті: https://www.sciencedirect.com

Поділитися з друзями: