Оцінка нового мультиплексного аналізу для діагностики алергії
страницы: 40-43
За останні роки в алергології відбулись, без перебільшення, революційні зрушення, вони стосуються насамперед нових методів діагностики, а саме молекулярної алергодіагностики, яка стрімко увійшла в повсякденну практику лікаря-алерголога, змінюючи парадигму розуміння причини розвитку тої чи тої алергічної патологіі і надаючи більш таргетні дані щодо лікувальних та елімінаційних заходів. Водночас відбувається певна еволюція самих методів молекулярної алергодіагностики, щороку відкривають нові молекули алергенів, які з часом з’являються в оновлюваних системах діагностики.Багатокомпонентний тест-аналізатор нового покоління ALEX (Allergy Explorer) з’явився на ринку відносно нещодавно, але вже встиг здобути прихильність як практикуючих лікарів, так і науковців світового рівня. Велика кількість досліджень ALEX була зроблена в Україні і на загал вже представлені перші результати щодо ефективності, специфічності та чутливості методу. Як будь-який новий метод у медицині, ALEX-тест активно вивчається, й доказова база щодо нього тільки накопичується, але має велике значення, щоб дослідження були якісними, виконані авторитетними вченими й опубліковані в авторитетних наукових виданнях. Пропонуємо до вашої уваги переклад одного з таких досліджень, яке вийшло у 2019 р. в рамках журналу Clinica Chimica Acta видавничої компанії Elsevier.
На сучасному етапі молекулярна алергодіагностика (МАД) значно покращила якість діагностики алергії, надаючи можливість відрізняти справжню сенсибілізацію від перехресних реакцій, з важливим каскадом даних щодо вибору причинно-значущих алергенів для проведення алерген-специфічної імунотерапії, а також прогнозу ризику розвитку серйозних алергічних реакцій у разі харчової алергії [1, 2]. Проте, щоб повністю реалізувати цей потенціал, він має бути імплементований в рамках чіткої діагностичної платформи і заснований на достатньому рівні знань методів діагностики.
На сьогодні тестування МАД може проводитися за допомогою моно- або мультиплексного аналізу. Дотепер моноплексні аналізи були методом вибору в разі традиційного підходу до діагностики – «зверху вниз», це перший етап (перший рівень) діагностики алергії, в рамках якого лікар-алерголог, переходячи від історії хвороби, фізикальних даних до шкірного прик-тесту (ШПТ)/або визначення рівня IgE до екстрактів, обирає, які молекули мають бути протестовані, грунтуючись на даних анамнезу. Моноплексні системи МАД видають кількісний результат, є високоавтоматизованими (з можливістю дозування як екстрактів, так і молекул), економічно ефективними, якщо їх проводити за надійним діагностичним алгоритмом. З іншого боку, деякі види сенсибілізації можуть бути пропущені або недооцінені.
Мультиплексний аналіз, зі свого боку, пропонує ширше бачення профілю сенсибілізації пацієнта. Він застосовується, коли необхідно протестувати > 12–13 молекул (з клінічними та економічними перевагами) або в педіатричній категорії пацієнтів через невелику кількість необхідної сироватки. Мультиплексні системи є методом вибору в разі підходу «знизу вгору» – для тих клініцистів, які вирішують перейти від широкого лабораторного тестування до клінічного, а також у всіх тих клінічних випадках, які потребують після першого підходу «зверху вниз» розширити панель тестованих молекул («U-подібний підхід») [3].
Однак доступні мультиплексні аналізи є напівкількісними й менш чутливими, ніж моноплексні. Перший доступний на ринку мультиплексний аналіз, що його використовують в даний час, є мікрочіп (ISAC®, Thermo Fisher, Швеція), який дає змогу тестувати 112 різних молекул, як рекомбінантних, так і нативних, з невеликою кількістю сироватки (30 мкл) [4, 5].
Нещодавно був розроблений ще один макрочіп (Allergy Explorer-ALEX®, Macro-ArrayDX Відень, Австрія). Він містить 157 екстрактів алергенів і 125 молекулярних компонентів і, напевне, має найширший нині набір алергенів. Крім того, основний аналіз IgE до екстрактів алергенів у одному тесті дає змогу оцінити рівень IgE до відповідних специфічних і перехресно-реактивних компонентів. Нарешті, пригнічення перехресно-реактивних вуглеводних детермінант (cross-reactive carbohydrate determinants, CCD) додатково покращує специфічність IgE-аналізу.
Метою даного дослідження було представити аналітичні дані щодо ефективності нового методу алергодіагностики ALEX® в обраній популяції, порівнюючи його з ImmunoCAP® (Термо Фішер, Швеція). Два методи порівнювали на якісному та кількісному рівні. Також порівнювали кожен окремий метод з ШПТ з точки зору якісних результатів.
Матеріали та методи дослідження
вгоруЗагалом було проведено тестування 120 сироваток, отриманих з двох центрів в Італії. Середній вік досліджуваної популяції становив 29 років (від 3 до 69): 58 чоловіків і 62 жінки. В даній популяції 56 пацієнтів страждали на респіраторну алергію і 49 – на харчову. У підгрупі респіраторної алергії в 48 осіб було виявлено риніт: у 6 – легкий інтермітуючий (12%), 2 – легкий персистуючий (4%), 5 – середньотяжкий інтермітуючий (10%) і в 35 – середньої тяжкості персистуючий (70%). 14 пацієнтів страждали на алергічну астму. В популяції харчової алергії – 30 осіб з LTP-синдромом: 5 (16,7%) – з легкими симптомами, 17 (56,6%) – з помірними і 8 (26,7%) – з тяжкими симптомами, а також 19 – з алергією на волоський горіх/фундук: 5 (26,3%) пацієнтів – з легкими симптомами, 12 (63,1%) – з помірними і 2 (10,6%) – з тяжкими.
Сироватки досліджували за допомогою ALEX®, і результати порівнювали з даними, отриманими в моноплексному IgE-тесті ImmunoCAP® та ШПТ (ALK Abello для персика і Stallergens для всіх інших екстрактів), що проводилися раніше за клінічними показаннями відповідно до традиційних методів діагностики «зверху вниз». Рішення порівняти ALEX® з ImmunoCAP® виникло через необхідність поглянути на ефективність ALEX® як з точки зору якісних і кількісних результатів, так і для оцінки діагностики екстрактів і молекул.
У ALEX® різні алергени й компоненти наносять на нітроцелюлозну мембрану в чіпі картриджа, який потім інкубують з 0,5 мл 1:5 розведення сироватки при перемішуванні. Примітно, що сироватковий розчинник містить інгібітор CCD; дотримуючись цієї процедури без додаткової попередньої інкубації, виробник гарантує інгібування CCD на рівні 85%. Після двогодинної інкубації чіпи ретельно промивають, додають попередньо приготоване розведення людського IgE, міченого лужною фосфатазою, і інкубують упродовж 30 хв. Після чергового циклу інтенсивної промивки додають ферментний субстрат, і через 8 хв реакція завершується. Мембрани сушать, і інтенсивність колірної реакції для кожної плями алергену вимірюють за допомогою пари заряджених пристроїв камери.
Спеціальне програмне забезпечення оцифровує зображення і готує звіт, в якому перераховані алергени і компоненти, а також їхня оцінка в kUA/ml. Також вимірюється рівень загального IgE. Нарешті, виходить довільна калібрувальна крива внаслідок взаємодії чотирьох плям зі зменшенням концентрації специфічного IgE, що відповідає < 0,35 kUA/L, 0,35–1 kUA/L, 1–5 kUA/L, 5–15 kUA/L і > 15 kUA/L [6]. Ми вважали позитивною концентрацію ≥ 0,35 kUA/L як для ImmunoCAP®, так і для ALEX®.
Результати та їх обговорення
вгоруНаше дослідження вивчало ефективність нового мультиплексного аналізу ALEX® для виявлення антитіл IgE до пилку, пилових кліщів, екстрактів і молекул харчових алергенів. Було проведено якісний і кількісний аналіз з порівнянням ALEX® з моноплексним тестом ImmunoCAP®.
Аналіз екстрактів і молекул пилку
Аналіз екстрактів пилку показав істотну відповідність зі значенням k > 0,81 в 3/10 екстрактів; найменша відповідність спостерігалась щодо кипарису (k = 0), полину (k = 0,26) і амброзії (k = 0,16). Було виявлено, що ImmunoCAP® часто є позитивним, тоді як ALEX® лишається негативним. Щоб вивчити клінічну значимість таких результатів, ми проаналізували клінічні дані. У полісенсибілізованих пацієнтів ідентифікація клінічно значущого алергену часто є складним завданням, проте в досліджуваній популяції пацієнти використовували монітор алергії App для повідомлення про свої симптоми, що дає можливість зіставити оцінки симптомів з кількістю пилку. Аналіз, проведений для амброзії та кипарису, двох алергенів з суттєвими розбіжностями, виявив клінічну значимість результатів ImmunoCAP® у 3/12 (25%) пацієнтів для амброзії і 3/14 (21,4%) – для кипарису.
При порівнянні результатів, отриманих для IgE безпосередньо з молекулярними компонентами, загальна відповідність була майже ідеальною (k = 0,92), причому найнижча ефективність спостерігалась для Amb a 1 (основний детермінант амброзії).
Для всіх інших молекул результати демонструють хорошу відповідність між різними молекулами (k в діапазоні від 0,87 до 1). Молекулярний компонент пилку кипарису (Cup a 1) і молекулярний компонент полину (Artv 1) показали майже ідеальну відповідність, що дає змогу ідентифікувати пацієнтів, сенсибілізованих до кипарису й полину, що їх було «пропущено» під час визначення екстракту.
В результаті комбінованого аналізу екстрактів і молекулярних компонентів ми виявили деякі невідповідності. Всебічний аналіз виявив, що в 3 випадках (2 для полину і 1 для екстракту оливи) наявність CCD могла призвести до хибнопозитивних результатів в екстрактах ImmunoCAP®, тому під час тестування екстрактів пилку ImmunoCAP® часто є позитивним, тоді як ALEX® лишається негативним. У двох пацієнтів аналіз показав відсутність кореляції між визначенням екстракту амброзії та її молекулярного компонента. Так, амброзія і Amb a 1 був позитивний в ImmunoCAP® і негативний в ALEX®; не можна виключати, що в цих випадках CCD може зіграти свою роль, оскільки Amb a 1 є нативним в ImmunoCAP® і рекомбінантним в ALEX®.
Крім того, за даними Hemmer і співавт., целюлоза, яка використовується як носій твердої фази алергену в ImmunoCAP®, містить різну кількість CCD, достатню для того, щоб спричинити хибнопозитивні результати тесту з неглікозильованими рекомбінантними алергенами в пацієнтів з високим рівнем антитіл проти CCD IgE.
Аналіз харчових алергенів
В обох популяціях, як і очікувалося, екстракти показали меншу відповідність у порівнянні з молекулами. З точки зору молекулярних компонентів відподність була близькою до ідеальної для Pru p 3 і помірною для Ara h 9; проте в останньому випадку, коли ALEX® показав негативні результати, ImmunoCAP® був позитивним при низьких титрах (<1 кUА/L).
Аналіз, що його було проведено серед популяції, сенсибілізованої до волоського горіха/фундука, продемонстрував майже ідеальну відповідність щодо LTP (Cora 8); серед сімейства запасних білків хороший рівень відповідності спостерігався тільки для Cor a 9 (глобулін 11S), а не для Cor a 14 (альбумін 2S), причому 6 пацієнтів мали негативний результат згідно з ALEX® і позитивний при високих титрах на ImmunoCAP® (> 1 кUА/L) для Cor a 14. Слід підкреслити, що Cor a 14 є нативним в ALEX® і рекомбінантним в ImmunoCAP®. Більша чутливість ImmunoCAP® щодо виявлення алергії на горіхи була недавно продемонстрована також у порівнянні з мультиплексним методом, що використовується нині (ISAC®) [9].
ШПТ проти ImmunoCAP® і ALEX®
Відповідність ImmunoCAP® і ALEX® з ШПТ була відзначена як істотна для обох методів. Варто відзначити, що і ImmunoCAP®, і ALEX® представляють відповідність з ШПТ, яка є далекою від хорошої. В контексті дебатів між шкірним тестуванням і дослідженням in vitro [10, 11] ці дані викликають стурбованість з приводу чутливості та складу ШПТ і їх позиціонування як першого кроку в алгоритмі діагностики. Літературні дані свідчать, що чутливість ШПТ становить 70–95% і специфічність 80–97% для інгаляційних алергенів, що є гарантією підвищення чутливості ШПТ до 97–99%. Ефективність для харчових алергенів нижча з чутливістю і специфічністю 30–90% і 20–60% відповідно в залежності від алергену і типу підходу (екстракт проти прик-тестування) [12, 13].
Однак питання стандартизації мінорних і мажорних алергенних детермінант, сталість складу від партії до партії та інші обмеження методу все ще обумовлюють упередження щодо інтерпретації результатів ШПТ [13–16]. У зв’язку з цим імплементація мультиплексного аналізу (що містить як екстракти, так і молекули) заслуговує, принаймні, серйозного розгляду як методу діагностики першої лінії, зокрема в разі тестування з низьким вмістом алергенів (екстракти для ШПТ) або слабкою стабільністю [11]. Проте під час інтерпретації даних важливо пам’ятати, що, незалежно від методу діагностики, демонстрація паттерну IgE-сенсибілізації є тільки доказом сенсибілізації, і тільки кореляція даних з анамнезом захворювання і клінічними симптомами є важливою.
Висновки
вгоруДане дослідження, наскільки відомо авторам, є першим повідомленням про пряме порівняння мультиплексного дослідження ALEX® і моноплексного тесту ImmunoCAP®.
Результати дослідження продемонстрували істотну відповідність між цими двома методами з трохи меншою відповідністю щодо виявлення IgE для екстрактів, ніж для молекулярних компонентів, як для інгаляційних, так і для харчових алергенів. ALEX®, виконуючи кількісний аналіз, долає одне з основних обмежень мультиплексних аналізів. Технічні особливості даного методу здатні потенційно знизити витрати в порівнянні з мультиплексними аналізами першого покоління. З точки зору виконання, ALEX® підсилює всі переваги технології мультиплексного аналізу. Він являє собою простий у застосуванні метод з чітким визначенням факторів, які можуть вплинути на остаточний результат. Для тестування АLEX® потрібно лише одне визначення кожного алергену, а не потрійне, як у ISAC®, до того ж результати ImmunoCAP® потребують суттєвого узгодження даних.
Тим не менш, значення ALEX® в рутинних клінічних умовах потребує підтвердження. Зокрема, наступні дослідження мають зосереджуватись на оптимізації деяких реагентів, аналітичної чутливості, а також діагностичної чутливості й специфічності.
Як вже було зазначено, обмеження розміру вибірки могло вплинути на відповідність, особливо під час оцінки одного екстракту/молекулярного компоненту. Крім того, слід мати на увазі, що імунна відповідь людини, опосередкована IgE, є поліклональною і схильною до впливу генетики. Екстракти алергенів можуть бути гетерогенними, їх складно стандартизувати на хорошому молекулярному рівні, і, як підкреслює Мюллер [19], рекомбінантні молекули можуть демонструвати непередбачувану поведінку.
Наявність як екстрактів, так і молекулярних компонентів має полегшувати і, можливо, прискорювати отримання аналітичних показників, однак перш ніж використовувати ALEX® як еталонний метод у підході «знизу вгору», необхідно підтвердити дані в широкому масштабі та інтерпретувати їх у світлі клінічних даних.
У будь-якому випадку, наявність нового мультиплексного тесту, заснованого на достовірних наукових даних, стимулює дослідження в галузі молекулярної алергії.
Список літератури – у редакції.
Реферативний огляд статті BuzzuliniF. et al. «Evaluation of a new multiplex assay for allergy diagnosis», Clinica Chimica Acta 493 (2019), 73–78,
підготували Марія Капустина та Анна Артюх.
Повну версію дивіться на сайті: https://www.sciencedirect.com
