скрыть меню

Клиническое значение генотипирования облигатно-гепатотропных вирусов

страницы: 48-53

В.П. Малый1, д.м.н., профессор, зав. кафедрой инфекционных болезней, Т.И. Лядова2, к.м.н., доцент, В.В. Бойко1, О.В. Гололобова1, к.м.н. 1Харьковская медицинская академия последипломного образования, 2Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина

Malij_i_dr_6_7_2011.jpg

В структуре инфекционных заболеваний проблема вирусных гепатитов (ВГ) является одной из наиболее актуальных. Это обусловлено высоким уровнем заболеваемости, широким распространением среди населения, большим количеством незарегистрированных активных источников инфекции в виде больных с безжелтушными формами гепатитов, а также формированием хронических заболеваний печени с последующим переходом в цирроз и гепатоцеллюлярную карциному. Кроме того, при ВГ существует потенциальная угроза наиболее тяжелого фульминантного течения с развитием массивного некроза печени и печеночной комы с летальным исходом.
Такая ситуация обусловлена, с одной стороны, факторами хозяина – особенностями состояния макроорганизма, в частности особенностями реагирования иммунной системы; с другой – факторами вируса, которые позволяют ему противостоять механизмам иммунитета, выживать в макроорганизме, влиять на исходы заболевания и эффективность проводимой противовирусной терапии и т. п.
Современный этап клинических исследований характеризуется широким использованием новых высокоинформативных диагностических технологий, а именно молекулярно-генетических методов, таких как индикация специфических антител к вирусам посредством иммуноферментного анализа (ИФА), выявление нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК вирусов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с дальнейшим определением генотипа и геноварианта (рестрикционный анализ и метод прямого секвенирования). Эти методы верификации и идентификации возбудителей позволили значительно расширить существующие представления об этиологии облигатно-гепатотропных вирусов. Результаты генотипирования более однозначны по сравнению с другими методами исследования и предоставляют непосредственную информацию для выявления эволюционных и эпидемиологических связей различных изолятов вирусов.
В современной вирусологии существуют разные уровни генетической гетерогенности вирусов, способных вызывать гепатиты. В первую очередь следует различать термины: генотип, субтип и квазивид.
Генотип определяется как генетическая структура организма или клетки. В эволюционном контексте этот термин обозначает, что генотип характеризуется на основании геномных последовательностей. Если генотипы описывают с позиций серологических данных, тогда речь идет о субтипах или серотипах. Субтип – близкородственный изолят в пределах одного генотипа. Генетические варианты, которые могут находиться в одной клетке или организме, называют квазивидами.
Изоляты вируса гепатита А (HAV) подразделяют на 7 генотипов, которые обозначаются римскими цифрами от I до VII [4, 5]. Генотипы вируса I, II, III и VII вызывают заболевания у человека, а IV, V, VI – у обезьян. Отличия между изолятами HAV, выделенными в разных регионах мира, по нуклеотидным последовательностям геномной РНК составляют 15-25%, а на уровне генотипов и субтипов – 7,5%. При этом аминокислотные последовательности изолятов HAV достаточно консервативны, что объясняет наличие всего одного серотипа у конкретного вируса. По данным исследователей [19], наиболее тяжелое течение заболевания отмечается у лиц с генотипом IB, IIIA, тогда как среднетяжелые формы наблюдаются при IA генотипе.
О гетерогенности популяции вируса гепатита В (HBV) стало известно еще в середине 70-х годов прошлого столетия, когда экспериментально серологическими методами было доказано существование субтипов поверхностного антигена вируса – HBsAg. При этом была найдена одна общая детерминанта «а», которая в комбинации с 2 дополнительными детерминантами d/y и w/r образовывала 4 субтипа HBsAg: adw, ауw, adr, ауr. Позже были описаны новые варианты детерминант, и общее количество субтипов достигло 9. На основании анализа нуклеотидных последовательностей S-гена, изоляты HBV, выделенные в разных регионах мира, объединили в 8 основных генотипов, которые назвали заглавными буквами латинского алфавита: А, В, С, D, E, F, G и Н. Следует отметить, что полное соответствие между генотипами HBV и серотипами HBsAg не установлено. Так, изоляты HBV, которые относятся к четырем абсолютно разным генотипам А, В, С и F, могут иметь один и тот же серотип adw2 [5, 12, 16].
Вирус гепатита С (HCV) среди других вирусов гепатита характеризуется наибольшей генетической вариабельностью генома. Согласно классификации, все изоляты HCV группируются в 6 главных генотипов, которые обозначаются арабскими цифрами от 1 до 6. Внутри каждого генотипа выделяют субтипы, которые включают изоляты, состоящие из квазивидов. На принадлежность изолята к определенному субтипу указывают прописные латинские буквы, которые пишутся вслед за арабской цифрой: HCVla, HCVlb, HCVlc, HCV2a и т. д. В настоящее время известно более 100 субтипов HCV [14, 21].
Изоляты HDV сгруппированы в 3 генотипа, которые обозначаются римскими цифрами I, II, III [14, 21].
К настоящему времени предложено выделять 5 генотипов вируса гепатита G (HGV), у которых установлена территориальная закономерность распространения. Второй генотип HGV преобладает в Северной Америке, Европе, Азии и Северной Африке, первый – встречается только в Западной Африке, пятый – в Южной Америке, третий и четвертый – в Юго-Восточной Азии. По данным исследователей, на территории Украины, России и стран СНГ доминирует второй генотип HGV [6].
Верифицированный в 1997 г. ДНК-содержащий вирус TTV имеет 16 генотипов – G1-G16, роль которых в патологии печени изучается [1].

Таким образом, популяции вирусов гепатитов насчитывают сотни генетических вариантов. В связи с этим использование рутинных лабораторных методов диагностики ВГ, основанных на определении антигенов и антител, не может дать информации об особенностях циркуляции разных вариантов вирусов среди населения, о наличии связи между изолятами, выделенными как от отдельных пациентов, так и групп пациентов, вовлеченных во вспышки, количество которых за последние годы значительно возросло.
В настоящее время молекулярно-генетические методы типирования гепатотропных вирусов составляют основу молекулярной эпидемиологии ВГ, целью которой является изучение циркуляции отдельных генетических вариантов возбудителей и их причинной связи с возникновением и распространением инфекционных заболеваний. К сожалению, изучение генотипов облигатно-гепатотропных вирусов, циркулирующих на территории Украины, и их влияния на течение и исходы заболевания является крайне слабым звеном в работе лабораторной службы Украины.
Цель исследования: на основании генодиагностических исследований изучить клиническое течение, тяжесть и последствия ВГ с разнообразными механизмами передачи инфекции.
Основные задачи исследования:
  • • Провести генотипирование HAV, HBV, HCV, HDV и выявить РНК И ДНК НGV и TTV, определить циркулирующие генотипы и их субтипы в исследуемых регионах.
  • • Выявить возможные различия в клинических проявлениях заболевания в зависимости от установленных генотипов и геновариантов вирусов.
  • • Установить связь с клиническими проявлениями заболевания у пациентов с ВГ.

Материалы и методы исследования

Результаты нашей работы базируются на обследовании 141 больного с ВГА в различных регионах Украины; 163 пациента с острым ВГВ – в Харьковском регионе, 76 больных с острым ВГВ и 54 пациента с хроническим ВГВ – в Закарпатском регионе; 155 пациентов с HCV-инфекцией: острый ВГС установлен у 37 больных, хронический ВГС – у 117.
Диагноз устанавливался с учетом комплекса клинико-эпидемиологических, лабораторно-инструментальных данных обследования и подтверждался выявлением в сыворотке крови специфических серологических маркеров ВГ (анти-НАV IgM, HBsAg, анти-HBc IgM, анти-HBc IgG, HBeAg, анти-НВе, анти-НСV (сум.), анти-HCV IgM и IgG, анти-HCV core и анти-HCV NS-3, NS-4, NS-5, анти-НDV IgM) методом ИФА (ELISA) посредством тест-систем НПО «Диагностические системы» (Россия) и ПЦР (РНК HAV, ДНК НВV и РНК HDV, PHK HCV, РНК HGV и ДНК TTV). Клинико-патогенетические варианты течения, форму и степень тяжести ВГ определяли согласно общепринятым в клинической практике критериям (МКБ-10).
Материалом для наших исследований была сыворотка крови больных в разные периоды заболевания (разгара, реконвалесценции).
Молекулярно-биологические исследования включали определение репликативной активности на основании выявления в сыворотке крови РНК и ДНК исследуемых вирусов методом ПЦР с использованием тест-систем ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ. Генотипирование вирусов проводилось с использованием рестрикционного анализа по методу М. Мizokami и соавт. (1999) в модификации ЦНИИЭ г. Москва.
Полученные результаты исследований статистически обработаны с использованием методов вариационной статистики посредством программ «Exсel-2002» и «STATISTIKA for Windows» (Statsoft Inc, США) на компьютере с процессором CPU Athlon 64-3200 Tray.

Результаты исследований и их обсуждение

Выявление и обследование больных с ВГА, как отмечалось, проводилось в различных регионах Украины. Среди обследованных пациентов (n=141) у 16% была выявлена микст-инфекция (HAV и HBV – в 9,6% и HAV и HCV – в 6,4%).
При генотипировании HAV в 75% случаев (105 больных) был выявлен генотип 1А, у 36 пациентов – генотип 3А, что составило 25% (рис. 1). Удельный вес различных генотипов HAV у больных в разных регионах Украины представлен на рис. 2. Следует отметить, что в Закарпатской, Полтавской и Николаевской областях среди спорадических случаев ВГА был выявлен только доминирующий генотип 1А.
Важно подчеркнуть, что при изучении тяжести течения ВГА в зависимости от выявленного генотипа нами было установлено, что у лиц с генотипом 3А отмечалось более тяжелое течение заболевания по сравнению с таковым у больных с генотипом 1А (рис. 3).
Таким образом, генотипирование HAV у больных с разным течением ВГА позволило выявить два генотипа: 1А и 3А. Генотип 1А являлся доминирующим среди спорадических случаев ВГА, поскольку его частота составила 75%, а генотип 3А встречался значительно реже – у 25% больных.
Клинически у пациентов с установленным генотипом НАV 1А заболевание имело циклическое течение с различной степенью тяжести, однако превалировали легкие формы (61 и 39%), тогда как у больных с генотипом 3А регистрировался больший процент средне-тяжелых форм болезни (42 и 58% соответственно).
При генотипировании HBV у 84,5% больных (n=208) был установлен генотип D, у 17 пациентов – генотип А, что составило 8,4%. У 14 (7,1%) больных была выявлена ДНК НВV, но генотип вируса установить не удалось (рис. 4).
По результатам генодиагностических исследований с определением генотипов HBV у пациентов с острым ВГВ установлено значительное преобладание как в Харьковском, так и Закарпатском регионе генотипа D (90,8 и 71,1%) и редкая встречаемость генотипа А (2,5 и 19,7% соответственно).
Следует отметить, что частота выявления генотипа А HBV в Закарпатском регионе значительно превышала таковую среди пациентов с острой НВV-инфекцией в Харьковском регионе – 19,7 и 2,5% соответственно, что является свидетельством особенности территориального распространения генотипов НВV в Украине.
При обследовании больных с хроническим ВГВ была зарегистрирована почти одинаковая частота как генотипа А, так и генотипа D HBV – 41,8 и 39,2% соответственно.

Некоторые специалисты считают, что генотип А HBV имеет более низкую антигенность по сравнению с генотипом D и вследствие этого – более низкую способность, чем генотип D, индуцировать иммунный ответ, поэтому данный генотип ассоциируется с большим риском развития хронического гепатита.
Для выявления возможной взаимосвязи между клиническими проявлениями заболевания и генотипом НВV нами проводилось сравнение частоты отдельных клинических симптомов в зависимости от установленного генотипа вируса (табл. 1).

Таблица 1. Частота основных клинических симптомов у пациентов с острым ВГВ в зависимости от генотипа НВV (%)
Клинические проявления
Генотип А
(n=15)
Генотип D
(n=54)
Общая слабость
100
100
Снижение аппетита
100
100
Тошнота
93,3
85,2
Тяжесть в правом подреберье
100
90,7
Тяжесть в эпигастрии
80*
46,3
Кожный зуд
46,7*
18,5
Артралгии
20
16,7
Повышение температуры тела
33,3
29,6
Желтуха
100
100
Гепатомегалия
100
100
Примечание: *р<0,05 между данными среди различных генотипов.
Данные таблицы показывают, что у пациентов с генотипом А HBV чаще встречались тяжесть в эпигастрии – у 80%, тогда как у лиц с генотипом D – в 46,3% случаев (р<0,05). Кожный зуд отмечался в 46,7 и 18,5% случаев соответственно (р<0,05). Также значительно чаще у больных с генотипом А по сравнению с генотипом D отмечались тошнота – в 93,3% случаев (р>0,05), артралгии – в 20% (р>0,05), повышение температуры тела – в 33% случаев (р>0,05), однако указанные значения не отличались статистической достоверностью.
Анализируя данные некоторых биохимических показателей у пациентов с острым ВГВ в зависимости от выявленного генотипа было установлено, что для лиц с генотипом А НВV свойственно более выраженное повышение активности трансаминаз (АлАТ в острый период повышалась до 7,5±0,4 ммоль/л•ч, в то время как у больных с генотипом D – до 5,3±0,2 ммоль/л•ч; р<0,05; табл. 2). Уровень общего белка в группе больных с генотипом А имел тенденцию к снижению (60,9±3,2 г/л) по сравнению с соответствующим показателем у пациентов с генотипом D (69,5±2,9 г/л; р<0,05).

Таблица 2. Уровни отдельных биохимических показателей в сыворотке крови у пациентов с острым ВГВ в зависимости от генотипа НВV
Генотипы HBV
Общий
билирубин,
мкмоль/л
АлАТ
ммоль/л•ч
Общий
белок,
г/л
Генотип А (n=15)
223,3±9,2*
7,5±0,4*
60,9±3,2
Генотип D (n=54)
211,4±7,3
5,3±0,2
69,5±2,9*
Примечание: *р<0,05 между данными среди различных генотипов.
При сравнении частоты клинических проявлений хронического ВГВ в зависимости от установленного генотипа HBV у лиц, которые находились под нашим наблюдением, также были выявлены некоторые различия (табл. 3).

Таблица 3. Частота основных клинических симптомов у пациентов с хроническим ВГВ в зависимости от генотипа НВV (%)
Клинические проявления
Генотип А
(n=15)
Генотип D
(n=54)
Общая слабость
100
100
Снижение аппетита
96,8*
69,7
Тошнота
54,8*
18,2
Тяжесть в правом подреберье
93,5*
54,5
Тяжесть в эпигастрии
32,3*
12,1
Кожный зуд
16,1*
3,1
Артралгии
3,2
3,1
Желтуха
100
100
Повышение температуры тела
22,6*
9,1
Гепатомегалия
100
100
Примечание: *р<0,05 между данными среди различных генотипов.
Проявления диспепсического синдрома чаще наблюдались у лиц с генотипом А HBV по сравнению с пациентами с генотипом D: снижение аппетита (96,8% против 69,7%), тошнота (54,8% против 18,2%), тяжесть в правом подреберье (93,5% против 54,5% случаев; р<0,05).
У больных с генотипом А HBV также значительно чаще отмечались боли при пальпации в правом подреберье, при этом средние показатели отличались статистической достоверностью (р<0,05). Это коррелировало с жалобами таких пациентов на тяжесть в правом подреберье (р>0,05). Кроме того, у больных с хроническим ВГВ с генотипом А HBV желтуха проявлялась в 2,5 раза чаще, чем у пациентов с генотипом D – 22,6 против 9,1% (р<0,05). У всех пациентов с хроническим ВГВ и установленными генотипами А и D HBV отмечались общая слабость и гепатомегалия.
Изучая биохимические показатели сыворотки крови у больных с хроническим ВГВ, в зависимости от установленных генотипов HBV были выявлены (табл. 4) более высокие показатели активности АлАТ у лиц с генотипом А (5,6±0,8 ммоль/л•ч) по сравнению с аналогичными при генотипе D, которые в среднем составляли 3,7±0,4 ммоль/л•ч (р<0,05).

Таблица 4. Уровни отдельных биохимических показателей в сыворотке крови у пациентов с хроническим ВГВ в зависимости от генотипа НВV
Генотипы HBV
Общий
билирубин,
мкмоль/л
АлАТ
ммоль/л•ч
Гамма-
глобулин,
г/л
Генотип А (n=31)
85,9±10,5*
5,6±0,8*
31,4±2,6
Генотип D (n=33)
58,4±9,2
3,7±0,4
28,2±1,8
Примечание: *р<0,05 между данными среди различных генотипов.

Список литературы находится в редакции

У пациентов с генотипом А уровень общего билирубина превышал таковой у пациентов с генотипом D – 85,9±10,5 и 58,4±9,2 мкмоль/л (р<0,05) соответственно.
Диспротеинемия при воспалительно-некротических процессах печеночной ткани также была несколько выше в группе больных с генотипом А. Так, концентрация гамма-глобулина у пациентов с данным генотипом составляла 31,4±2,6 г/л, а с генотипом D – 28,2±1,8 г/л (р>0,05). Полученные результаты биохимических исследований поражения печени свидетельствуют о более высокой активности инфекционного процесса у больных с хроническим ВГВ с генотипом А в отличие от пациентов с генотипом D.
Изучение особенностей клинических проявлений острой и хронической HBV-инфекции в зависимости от установленного генотипа показало, что у больных, инфицированных генотипом D HBV, наблюдалось более мягкое течение как острого, так и хронического ВГВ, с менее выраженной клинической симптоматикой, умеренным проявлением мезенхимально-воспалительного и цитолитического синдромов и умеренными биохимическими изменениями в сыворотке крови. И наоборот, у пациентов с генотипом А НВV отмечалось более выраженное течение болезни с преобладанием диспепсических проявлений, с большей активностью некробиотических и воспалительных процессов в печени. Все это подчеркивает более высокую вирулентность и иммуногенность генотипа А НВV, с более частым развитием хронизации процесса у данной группы больных.
Для изучения генотипов HDV нами было обследовано 155 больных с HBV-инфекцией: 76 – с острым ВГВ и 79 – хроническим ВГВ. Среди обследованных у 18 (11,6%) пациентов была выявлена РНК HDV, из них 38,8% – у мужчин (7 человек) и 61,2% – у женщин (11 человек; рис. 5, 6).
Анализ полученных результатов показал, что среди пациентов с острым ВГВ РНК HDV была выявлена у 7 (9,2%) человек, тогда как среди пациентов с хроническим ВГВ – у 11 (13,9%). При этом был установлен генотип І вируса, субтип а. Согласно данным исследователей именно этот генотип обусловливает легкие формы инфекции с высокой частотой хронизации процесса, тогда как генотип ІІ отличается менее патогенными свойствами. Генотип III связывают с развитием фульминантных форм HDV-инфекции.
Для определения циркулирующих генотипов HCV было обследовано 155 больных с HCV-инфекцией, среди них острый ВГС установлен в 23,9% случаев, хронический ВГС – 76,1%. Частота выявления отдельных генотипов HCV представлена на рис. 7.
В ходе анализа результатов молекулярно-генетических исследований было установлено, что РНК НСV определялась в крови всех больных с острым ВГС и у 77,89% пациентов с хроническим ВГС. Генотип HCV 1b оказался наиболее распространенным как среди больных с острым ВГС (50%), так и хроническим ВГС (43,3%). Второе место занял генотип 3а, который регистрировался у 30 и 38,3% больных с острым и хроническим ВГС соответственно. У пациентов с острым ВГС с одинаковой частотой (10%) встречались генотипы 1b/3а и 2. Комбинация генотипов 1а/3а и изолированный моногенотип 1а у больных с острым ВГС не определялись. В то же время у пациентов с хроническим ВГС комбинация генотипов 1b/3а определялась в 6,7%. С одинаковой частотой (5,0%) регистрировались комбинации генотипов 1а/3а и моногенотип 1а. Частота регистрации генотипа 2 была наиболее редкой – всего у 1,7% больных с хроническим ВГС.
Состояние иммунной регуляции у пациентов с НСV-инфекцией, как известно, зависит от репликативной и цитолитической активности вируса, а также его генотипа. В результате проведенных иммунологических исследований установлено, что у больных с острым и хроническим ВГС с генотипом HCV 3а наблюдается превалирование клеточного звена иммунитета, тогда как при генотипе 1b – гуморального.
В крови пациентов с хроническим ВГС по мере роста степени биохимической активности отмечается статистически достоверное снижение уровней клеточных иммунных показателей наряду с одновременным повышением показателей гуморального звена иммунитета.
Для обнаружения возможной инфицированности HGV и ТТV в Украине нами были обследованы больные с острыми и хроническими формами HBV-инфекции.
При обследовании 76 пациентов с острым ВГВ в 14,47% случаев (11 человек) методом ПЦР была выявлена РНК HGV. В то же время у 79 больных с хроническим ВГВ данный вирус был верифицирован только в 5% случаев (4 человека; рис. 8).
Проведенный анализ на наличие ДНК ТТV методом ПЦР позволил выявить среди больных с острой НВV-инфекцией вирус TTV в 72,8% случаев (51 пациент; рис. 9, 10).
Следует отметить, что при сравнении отдельных клинических проявлений заболевания и биохимических изменений, а также длительности стационарного лечения достоверных отличий между ТТV-позитивными и ТТV-негативными группами больных с острым ВГВ выявлено не было, что требует более детального изучения этого явления с участием большего количества пациентов.

Выводы

  • Генетические особенности вирусов гепатитов могут определять течение и исходы инфекционного процесса.
  • Генотипические особенности вирусов могут являться маркерами прогноза эффективности противовирусной терапии и стойкости вирусов к используемым препаратам.
  • Для более полного понимания патогенеза заболевания необходимо изучение генетических особенностей возбудителя на разных уровнях гетерогенности.

Наш журнал
в соцсетях:

Выпуски за 2011 Год

Содержание выпуска 9-10 (48-49), 2011

  1. Л.Д. Тодоріко

Содержание выпуска 8 (47), 2011

  1. В.А. Савоськина

Содержание выпуска 3, 2011

Содержание выпуска 5 (44), 2011

Содержание выпуска 4 (43), 2011

Содержание выпуска 2, 2011

Содержание выпуска 1 (40), 2011

Содержание выпуска 2 (41), 2011

Содержание выпуска 1, 2011

  1. С.В. Возианова

Выпуски текущего года

Содержание выпуска 3-4 (124-125), 2020

  1. Д.В. Мальцев

  2. Б.М. Пухлик

  3. В. Зайков, П. В. Гришило, А. П. Гришило

  4. A. G. Corsico, S. Leonardi, . A. Licari et al.

  5. О. С. Бильченко, Т. С. Оспанова, В. А. Савоськина, Е. А. Красовская, О. В. Веремеенко

  6. M. Levin, I.J. Ansotegui, . J. Bernstein et al.

  7. A. Bedard, X. Basagana, . J.M. Anto et al.

  8. Г. Є. Ананьїна, І. П. Висеканцев, О. С. Онасенко, Л. В. Степанюк, В. Л. Пономарьова

Содержание выпуска 2 (123), 2020

  1. И. П. Кайдашев

  2. С.В. Зайков, П. В. Гришило, А. П. Гришило

  3. К. Ю. Гашинова

  4. С.О. Зубченко, С.Д. Юр’єв, С.Д. Юр’єв

  5. С.Д. Юр’єв

  6. А.Є. Богомолов

  7. Jean Bousqueta, Holger J. Schunemann, Akdis Togias et al.

Содержание выпуска 1 (122), 2020

  1. О. А. Ошлянська, Т. Г. Надточій, М. Ф. Денисова, Л. І. Омельченко, Л. Ф. Слєпова, Н.М. Музика, А. Г. Арцимович

  2. Ю.В. Шукліна

  3. Yu Chen, Qianyun Liu, Deyin Guo

  4. Carlo Caffarelli, Francesco Paravati, Maya El Hachem et al.

  5. M. Lauriello, P. Muzi, L. Di Rienzo et al.