Article types:
Original Research
Клиническое значение генотипирования облигатно-гепатотропных вирусов
pages: 48-53
В структуре инфекционных заболеваний проблема вирусных гепатитов (ВГ) является одной из наиболее актуальных. Это обусловлено высоким уровнем заболеваемости, широким распространением среди населения, большим количеством незарегистрированных активных источников инфекции в виде больных с безжелтушными формами гепатитов, а также формированием хронических заболеваний печени с последующим переходом в цирроз и гепатоцеллюлярную карциному. Кроме того, при ВГ существует потенциальная угроза наиболее тяжелого фульминантного течения с развитием массивного некроза печени и печеночной комы с летальным исходом.
Такая ситуация обусловлена, с одной стороны, факторами хозяина – особенностями состояния макроорганизма, в частности особенностями реагирования иммунной системы; с другой – факторами вируса, которые позволяют ему противостоять механизмам иммунитета, выживать в макроорганизме, влиять на исходы заболевания и эффективность проводимой противовирусной терапии и т. п.
Современный этап клинических исследований характеризуется широким использованием новых высокоинформативных диагностических технологий, а именно молекулярно-генетических методов, таких как индикация специфических антител к вирусам посредством иммуноферментного анализа (ИФА), выявление нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК вирусов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с дальнейшим определением генотипа и геноварианта (рестрикционный анализ и метод прямого секвенирования). Эти методы верификации и идентификации возбудителей позволили значительно расширить существующие представления об этиологии облигатно-гепатотропных вирусов. Результаты генотипирования более однозначны по сравнению с другими методами исследования и предоставляют непосредственную информацию для выявления эволюционных и эпидемиологических связей различных изолятов вирусов.
В современной вирусологии существуют разные уровни генетической гетерогенности вирусов, способных вызывать гепатиты. В первую очередь следует различать термины: генотип, субтип и квазивид.
Генотип определяется как генетическая структура организма или клетки. В эволюционном контексте этот термин обозначает, что генотип характеризуется на основании геномных последовательностей. Если генотипы описывают с позиций серологических данных, тогда речь идет о субтипах или серотипах. Субтип – близкородственный изолят в пределах одного генотипа. Генетические варианты, которые могут находиться в одной клетке или организме, называют квазивидами.
Изоляты вируса гепатита А (HAV) подразделяют на 7 генотипов, которые обозначаются римскими цифрами от I до VII [4, 5]. Генотипы вируса I, II, III и VII вызывают заболевания у человека, а IV, V, VI – у обезьян. Отличия между изолятами HAV, выделенными в разных регионах мира, по нуклеотидным последовательностям геномной РНК составляют 15-25%, а на уровне генотипов и субтипов – 7,5%. При этом аминокислотные последовательности изолятов HAV достаточно консервативны, что объясняет наличие всего одного серотипа у конкретного вируса. По данным исследователей [19], наиболее тяжелое течение заболевания отмечается у лиц с генотипом IB, IIIA, тогда как среднетяжелые формы наблюдаются при IA генотипе.
О гетерогенности популяции вируса гепатита В (HBV) стало известно еще в середине 70-х годов прошлого столетия, когда экспериментально серологическими методами было доказано существование субтипов поверхностного антигена вируса – HBsAg. При этом была найдена одна общая детерминанта «а», которая в комбинации с 2 дополнительными детерминантами d/y и w/r образовывала 4 субтипа HBsAg: adw, ауw, adr, ауr. Позже были описаны новые варианты детерминант, и общее количество субтипов достигло 9. На основании анализа нуклеотидных последовательностей S-гена, изоляты HBV, выделенные в разных регионах мира, объединили в 8 основных генотипов, которые назвали заглавными буквами латинского алфавита: А, В, С, D, E, F, G и Н. Следует отметить, что полное соответствие между генотипами HBV и серотипами HBsAg не установлено. Так, изоляты HBV, которые относятся к четырем абсолютно разным генотипам А, В, С и F, могут иметь один и тот же серотип adw2 [5, 12, 16].
Вирус гепатита С (HCV) среди других вирусов гепатита характеризуется наибольшей генетической вариабельностью генома. Согласно классификации, все изоляты HCV группируются в 6 главных генотипов, которые обозначаются арабскими цифрами от 1 до 6. Внутри каждого генотипа выделяют субтипы, которые включают изоляты, состоящие из квазивидов. На принадлежность изолята к определенному субтипу указывают прописные латинские буквы, которые пишутся вслед за арабской цифрой: HCVla, HCVlb, HCVlc, HCV2a и т. д. В настоящее время известно более 100 субтипов HCV [14, 21].
Изоляты HDV сгруппированы в 3 генотипа, которые обозначаются римскими цифрами I, II, III [14, 21].
К настоящему времени предложено выделять 5 генотипов вируса гепатита G (HGV), у которых установлена территориальная закономерность распространения. Второй генотип HGV преобладает в Северной Америке, Европе, Азии и Северной Африке, первый – встречается только в Западной Африке, пятый – в Южной Америке, третий и четвертый – в Юго-Восточной Азии. По данным исследователей, на территории Украины, России и стран СНГ доминирует второй генотип HGV [6].
Верифицированный в 1997 г. ДНК-содержащий вирус TTV имеет 16 генотипов – G1-G16, роль которых в патологии печени изучается [1].
| Таким образом, популяции вирусов гепатитов насчитывают сотни генетических вариантов. В связи с этим использование рутинных лабораторных методов диагностики ВГ, основанных на определении антигенов и антител, не может дать информации об особенностях циркуляции разных вариантов вирусов среди населения, о наличии связи между изолятами, выделенными как от отдельных пациентов, так и групп пациентов, вовлеченных во вспышки, количество которых за последние годы значительно возросло. |
В настоящее время молекулярно-генетические методы типирования гепатотропных вирусов составляют основу молекулярной эпидемиологии ВГ, целью которой является изучение циркуляции отдельных генетических вариантов возбудителей и их причинной связи с возникновением и распространением инфекционных заболеваний. К сожалению, изучение генотипов облигатно-гепатотропных вирусов, циркулирующих на территории Украины, и их влияния на течение и исходы заболевания является крайне слабым звеном в работе лабораторной службы Украины.
Цель исследования: на основании генодиагностических исследований изучить клиническое течение, тяжесть и последствия ВГ с разнообразными механизмами передачи инфекции.
Основные задачи исследования:
- • Провести генотипирование HAV, HBV, HCV, HDV и выявить РНК И ДНК НGV и TTV, определить циркулирующие генотипы и их субтипы в исследуемых регионах.
- • Выявить возможные различия в клинических проявлениях заболевания в зависимости от установленных генотипов и геновариантов вирусов.
- • Установить связь с клиническими проявлениями заболевания у пациентов с ВГ.
Материалы и методы исследования
Результаты нашей работы базируются на обследовании 141 больного с ВГА в различных регионах Украины; 163 пациента с острым ВГВ – в Харьковском регионе, 76 больных с острым ВГВ и 54 пациента с хроническим ВГВ – в Закарпатском регионе; 155 пациентов с HCV-инфекцией: острый ВГС установлен у 37 больных, хронический ВГС – у 117.
Диагноз устанавливался с учетом комплекса клинико-эпидемиологических, лабораторно-инструментальных данных обследования и подтверждался выявлением в сыворотке крови специфических серологических маркеров ВГ (анти-НАV IgM, HBsAg, анти-HBc IgM, анти-HBc IgG, HBeAg, анти-НВе, анти-НСV (сум.), анти-HCV IgM и IgG, анти-HCV core и анти-HCV NS-3, NS-4, NS-5, анти-НDV IgM) методом ИФА (ELISA) посредством тест-систем НПО «Диагностические системы» (Россия) и ПЦР (РНК HAV, ДНК НВV и РНК HDV, PHK HCV, РНК HGV и ДНК TTV). Клинико-патогенетические варианты течения, форму и степень тяжести ВГ определяли согласно общепринятым в клинической практике критериям (МКБ-10).
Материалом для наших исследований была сыворотка крови больных в разные периоды заболевания (разгара, реконвалесценции).
Молекулярно-биологические исследования включали определение репликативной активности на основании выявления в сыворотке крови РНК и ДНК исследуемых вирусов методом ПЦР с использованием тест-систем ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ. Генотипирование вирусов проводилось с использованием рестрикционного анализа по методу М. Мizokami и соавт. (1999) в модификации ЦНИИЭ г. Москва.
Полученные результаты исследований статистически обработаны с использованием методов вариационной статистики посредством программ «Exсel-2002» и «STATISTIKA for Windows» (Statsoft Inc, США) на компьютере с процессором CPU Athlon 64-3200 Tray.
Результаты исследований и их обсуждение
Выявление и обследование больных с ВГА, как отмечалось, проводилось в различных регионах Украины. Среди обследованных пациентов (n=141) у 16% была выявлена микст-инфекция (HAV и HBV – в 9,6% и HAV и HCV – в 6,4%).
При генотипировании HAV в 75% случаев (105 больных) был выявлен генотип 1А, у 36 пациентов – генотип 3А, что составило 25% (рис. 1). Удельный вес различных генотипов HAV у больных в разных регионах Украины представлен на рис. 2. Следует отметить, что в Закарпатской, Полтавской и Николаевской областях среди спорадических случаев ВГА был выявлен только доминирующий генотип 1А.
Важно подчеркнуть, что при изучении тяжести течения ВГА в зависимости от выявленного генотипа нами было установлено, что у лиц с генотипом 3А отмечалось более тяжелое течение заболевания по сравнению с таковым у больных с генотипом 1А (рис. 3).
Таким образом, генотипирование HAV у больных с разным течением ВГА позволило выявить два генотипа: 1А и 3А. Генотип 1А являлся доминирующим среди спорадических случаев ВГА, поскольку его частота составила 75%, а генотип 3А встречался значительно реже – у 25% больных.
Клинически у пациентов с установленным генотипом НАV 1А заболевание имело циклическое течение с различной степенью тяжести, однако превалировали легкие формы (61 и 39%), тогда как у больных с генотипом 3А регистрировался больший процент средне-тяжелых форм болезни (42 и 58% соответственно).
При генотипировании HBV у 84,5% больных (n=208) был установлен генотип D, у 17 пациентов – генотип А, что составило 8,4%. У 14 (7,1%) больных была выявлена ДНК НВV, но генотип вируса установить не удалось (рис. 4).
По результатам генодиагностических исследований с определением генотипов HBV у пациентов с острым ВГВ установлено значительное преобладание как в Харьковском, так и Закарпатском регионе генотипа D (90,8 и 71,1%) и редкая встречаемость генотипа А (2,5 и 19,7% соответственно).
Следует отметить, что частота выявления генотипа А HBV в Закарпатском регионе значительно превышала таковую среди пациентов с острой НВV-инфекцией в Харьковском регионе – 19,7 и 2,5% соответственно, что является свидетельством особенности территориального распространения генотипов НВV в Украине.
При обследовании больных с хроническим ВГВ была зарегистрирована почти одинаковая частота как генотипа А, так и генотипа D HBV – 41,8 и 39,2% соответственно.
| Некоторые специалисты считают, что генотип А HBV имеет более низкую антигенность по сравнению с генотипом D и вследствие этого – более низкую способность, чем генотип D, индуцировать иммунный ответ, поэтому данный генотип ассоциируется с большим риском развития хронического гепатита. |
Для выявления возможной взаимосвязи между клиническими проявлениями заболевания и генотипом НВV нами проводилось сравнение частоты отдельных клинических симптомов в зависимости от установленного генотипа вируса (табл. 1).
Клинические проявления |
Генотип А (n=15) |
Генотип D (n=54) |
|
Общая слабость |
100 |
100 |
|
Снижение аппетита |
100 |
100 |
|
Тошнота |
93,3 |
85,2 |
|
Тяжесть в правом подреберье |
100 |
90,7 |
|
Тяжесть в эпигастрии |
80* |
46,3 |
|
Кожный зуд |
46,7* |
18,5 |
|
Артралгии |
20 |
16,7 |
|
Повышение температуры тела |
33,3 |
29,6 |
|
Желтуха |
100 |
100 |
|
Гепатомегалия |
100 |
100 |
| Примечание: *р<0,05 между данными среди различных генотипов. | ||
Данные таблицы показывают, что у пациентов с генотипом А HBV чаще встречались тяжесть в эпигастрии – у 80%, тогда как у лиц с генотипом D – в 46,3% случаев (р<0,05). Кожный зуд отмечался в 46,7 и 18,5% случаев соответственно (р<0,05). Также значительно чаще у больных с генотипом А по сравнению с генотипом D отмечались тошнота – в 93,3% случаев (р>0,05), артралгии – в 20% (р>0,05), повышение температуры тела – в 33% случаев (р>0,05), однако указанные значения не отличались статистической достоверностью.
Анализируя данные некоторых биохимических показателей у пациентов с острым ВГВ в зависимости от выявленного генотипа было установлено, что для лиц с генотипом А НВV свойственно более выраженное повышение активности трансаминаз (АлАТ в острый период повышалась до 7,5±0,4 ммоль/л•ч, в то время как у больных с генотипом D – до 5,3±0,2 ммоль/л•ч; р<0,05; табл. 2). Уровень общего белка в группе больных с генотипом А имел тенденцию к снижению (60,9±3,2 г/л) по сравнению с соответствующим показателем у пациентов с генотипом D (69,5±2,9 г/л; р<0,05).
Генотипы HBV |
Общий билирубин, мкмоль/л |
АлАТ ммоль/л•ч |
Общий белок, г/л |
|
Генотип А (n=15) |
223,3±9,2* |
7,5±0,4* |
60,9±3,2 |
|
Генотип D (n=54) |
211,4±7,3 |
5,3±0,2 |
69,5±2,9* |
| Примечание: *р<0,05 между данными среди различных генотипов. | |||
При сравнении частоты клинических проявлений хронического ВГВ в зависимости от установленного генотипа HBV у лиц, которые находились под нашим наблюдением, также были выявлены некоторые различия (табл. 3).
Клинические проявления |
Генотип А (n=15) |
Генотип D (n=54) |
|
Общая слабость |
100 |
100 |
|
Снижение аппетита |
96,8* |
69,7 |
|
Тошнота |
54,8* |
18,2 |
|
Тяжесть в правом подреберье |
93,5* |
54,5 |
|
Тяжесть в эпигастрии |
32,3* |
12,1 |
|
Кожный зуд |
16,1* |
3,1 |
|
Артралгии |
3,2 |
3,1 |
|
Желтуха |
100 |
100 |
|
Повышение температуры тела |
22,6* |
9,1 |
|
Гепатомегалия |
100 |
100 |
| Примечание: *р<0,05 между данными среди различных генотипов. | ||
Проявления диспепсического синдрома чаще наблюдались у лиц с генотипом А HBV по сравнению с пациентами с генотипом D: снижение аппетита (96,8% против 69,7%), тошнота (54,8% против 18,2%), тяжесть в правом подреберье (93,5% против 54,5% случаев; р<0,05).
У больных с генотипом А HBV также значительно чаще отмечались боли при пальпации в правом подреберье, при этом средние показатели отличались статистической достоверностью (р<0,05). Это коррелировало с жалобами таких пациентов на тяжесть в правом подреберье (р>0,05). Кроме того, у больных с хроническим ВГВ с генотипом А HBV желтуха проявлялась в 2,5 раза чаще, чем у пациентов с генотипом D – 22,6 против 9,1% (р<0,05). У всех пациентов с хроническим ВГВ и установленными генотипами А и D HBV отмечались общая слабость и гепатомегалия.
Изучая биохимические показатели сыворотки крови у больных с хроническим ВГВ, в зависимости от установленных генотипов HBV были выявлены (табл. 4) более высокие показатели активности АлАТ у лиц с генотипом А (5,6±0,8 ммоль/л•ч) по сравнению с аналогичными при генотипе D, которые в среднем составляли 3,7±0,4 ммоль/л•ч (р<0,05).
Генотипы HBV |
Общий билирубин, мкмоль/л |
АлАТ ммоль/л•ч |
Гамма- глобулин, г/л |
|
Генотип А (n=31) |
85,9±10,5* |
5,6±0,8* |
31,4±2,6 |
|
Генотип D (n=33) |
58,4±9,2 |
3,7±0,4 |
28,2±1,8 |
| Примечание: *р<0,05 между данными среди различных генотипов. | |||
Список литературы находится в редакции
У пациентов с генотипом А уровень общего билирубина превышал таковой у пациентов с генотипом D – 85,9±10,5 и 58,4±9,2 мкмоль/л (р<0,05) соответственно.
Диспротеинемия при воспалительно-некротических процессах печеночной ткани также была несколько выше в группе больных с генотипом А. Так, концентрация гамма-глобулина у пациентов с данным генотипом составляла 31,4±2,6 г/л, а с генотипом D – 28,2±1,8 г/л (р>0,05). Полученные результаты биохимических исследований поражения печени свидетельствуют о более высокой активности инфекционного процесса у больных с хроническим ВГВ с генотипом А в отличие от пациентов с генотипом D.
Изучение особенностей клинических проявлений острой и хронической HBV-инфекции в зависимости от установленного генотипа показало, что у больных, инфицированных генотипом D HBV, наблюдалось более мягкое течение как острого, так и хронического ВГВ, с менее выраженной клинической симптоматикой, умеренным проявлением мезенхимально-воспалительного и цитолитического синдромов и умеренными биохимическими изменениями в сыворотке крови. И наоборот, у пациентов с генотипом А НВV отмечалось более выраженное течение болезни с преобладанием диспепсических проявлений, с большей активностью некробиотических и воспалительных процессов в печени. Все это подчеркивает более высокую вирулентность и иммуногенность генотипа А НВV, с более частым развитием хронизации процесса у данной группы больных.
Для изучения генотипов HDV нами было обследовано 155 больных с HBV-инфекцией: 76 – с острым ВГВ и 79 – хроническим ВГВ. Среди обследованных у 18 (11,6%) пациентов была выявлена РНК HDV, из них 38,8% – у мужчин (7 человек) и 61,2% – у женщин (11 человек; рис. 5, 6).
Анализ полученных результатов показал, что среди пациентов с острым ВГВ РНК HDV была выявлена у 7 (9,2%) человек, тогда как среди пациентов с хроническим ВГВ – у 11 (13,9%). При этом был установлен генотип І вируса, субтип а. Согласно данным исследователей именно этот генотип обусловливает легкие формы инфекции с высокой частотой хронизации процесса, тогда как генотип ІІ отличается менее патогенными свойствами. Генотип III связывают с развитием фульминантных форм HDV-инфекции.
Для определения циркулирующих генотипов HCV было обследовано 155 больных с HCV-инфекцией, среди них острый ВГС установлен в 23,9% случаев, хронический ВГС – 76,1%. Частота выявления отдельных генотипов HCV представлена на рис. 7.
В ходе анализа результатов молекулярно-генетических исследований было установлено, что РНК НСV определялась в крови всех больных с острым ВГС и у 77,89% пациентов с хроническим ВГС. Генотип HCV 1b оказался наиболее распространенным как среди больных с острым ВГС (50%), так и хроническим ВГС (43,3%). Второе место занял генотип 3а, который регистрировался у 30 и 38,3% больных с острым и хроническим ВГС соответственно. У пациентов с острым ВГС с одинаковой частотой (10%) встречались генотипы 1b/3а и 2. Комбинация генотипов 1а/3а и изолированный моногенотип 1а у больных с острым ВГС не определялись. В то же время у пациентов с хроническим ВГС комбинация генотипов 1b/3а определялась в 6,7%. С одинаковой частотой (5,0%) регистрировались комбинации генотипов 1а/3а и моногенотип 1а. Частота регистрации генотипа 2 была наиболее редкой – всего у 1,7% больных с хроническим ВГС.
Состояние иммунной регуляции у пациентов с НСV-инфекцией, как известно, зависит от репликативной и цитолитической активности вируса, а также его генотипа. В результате проведенных иммунологических исследований установлено, что у больных с острым и хроническим ВГС с генотипом HCV 3а наблюдается превалирование клеточного звена иммунитета, тогда как при генотипе 1b – гуморального.
В крови пациентов с хроническим ВГС по мере роста степени биохимической активности отмечается статистически достоверное снижение уровней клеточных иммунных показателей наряду с одновременным повышением показателей гуморального звена иммунитета.
Для обнаружения возможной инфицированности HGV и ТТV в Украине нами были обследованы больные с острыми и хроническими формами HBV-инфекции.
При обследовании 76 пациентов с острым ВГВ в 14,47% случаев (11 человек) методом ПЦР была выявлена РНК HGV. В то же время у 79 больных с хроническим ВГВ данный вирус был верифицирован только в 5% случаев (4 человека; рис. 8).
Проведенный анализ на наличие ДНК ТТV методом ПЦР позволил выявить среди больных с острой НВV-инфекцией вирус TTV в 72,8% случаев (51 пациент; рис. 9, 10).
Следует отметить, что при сравнении отдельных клинических проявлений заболевания и биохимических изменений, а также длительности стационарного лечения достоверных отличий между ТТV-позитивными и ТТV-негативными группами больных с острым ВГВ выявлено не было, что требует более детального изучения этого явления с участием большего количества пациентов.
Выводы
- Генетические особенности вирусов гепатитов могут определять течение и исходы инфекционного процесса.
- Генотипические особенности вирусов могут являться маркерами прогноза эффективности противовирусной терапии и стойкости вирусов к используемым препаратам.
- Для более полного понимания патогенеза заболевания необходимо изучение генетических особенностей возбудителя на разных уровнях гетерогенности.
