Ефективність неоад’ювантного застосування аміксину як засобу імунотерапії меланоми B-16 у мишей лінії C57BL

Застосування засобів імунотерапії дає змогу підвищити ефективність лікування онкологічних хворих за рахунок подолання толерантності імунної системи до пухлинних антигенів та реалізації більш ефективної протипухлинної відповіді. Питання щодо відновлення та підтримки повноцінного протипухлинного імунітету особливо гостро постає при лікуванні хворих на одне з найбільш агресивних злоякісних захворювань – меланому.

Результати численних досліджень свідчать про позитивний вплив імунотерапії на стан імунної системи хворих на меланому шкіри (як з первинними пухлинами, так і з метастазами) [1-5]. Проте відмічено, що результати проведеного лікування значно нижчі від очікуваних. Дискусійним залишається значення імунологічних реакцій для елімінації пухлинних клітин та гальмування росту меланоми [2, 6]. Тим не менше, тривають дослідження щодо розробки нових підходів у лікуванні хворих з цією пухлиною, особливо з урахуванням даних про антигенність та імуногенність останньої [7, 8].

Сучасні напрями імунотерапії меланоми охоплюють:

• застосування протипухлинних вакцин на основі антигенів меланоми або дендритних клітин [9];
• адоптивну Т-клітинну терапію [10, 11];
• терапію за допомогою онколітичних вірусів [12, 13];
• застосування препаратів на основі моноклональних антитіл [14, 15];
• цитокінотерапію за допомогою інтерлейкіну-2 (ІЛ-2) та інтерферону-γ (ІФН-γ) [16, 17].

Незважаючи на те що при лікуванні пацієнтів з меланомою ІФН використовують вже впродовж тривалого часу, дослідження ефективності різних схем інтерферонотерапії тривають і нині [18, 19]. Відомо, що ІФН відіграє важливу роль у реалізації протипухлинної відповіді завдяки вираженій імуномодулювальній дії за рахунок впливу практично на всі клітини-ефектори імунної системи. Застосування ІФН в післяопераційний період у хворих на меланому призводить до підсилення імунної відповіді, що дозволяє подовжити безрецидивний період та зменшити кількість метастазів [20, 21].

Показано, що використання високих доз екзогенного ІФН-α як засобу ад’ювантної терапії збільшує показник виживаності без прогресування захворювання (виникнення рецидивів та віддалених метастазів) у хворих на меланому шкіри ІІ–ІІІ стадій [22-24]. Проте застосування препаратів екзогенного ІФН в клінічній практиці має обмеження за рахунок значної кількості побічних ефектів та високої вартості лікування. Тому в онкології широко застосовується не лише ІФН, але й речовини, що стимулюють його продукцію, так звані індуктори ендогенного ІФН.

Саме до таких речовин належить і аміксин (тилорон) – низькомолекулярний синтетичний індуктор ІФН, що належить до класу флуоренонів [25, 26]. Він стимулює утворення в організмі ендогенного ІФН (α, β і γ) клітинами епітелію кишківника, гепатоцитами, Т-лімфоцитами, нейтрофілами, гранулоцитами з максимальною продукцією через 4-24 год, що забезпечує швидкий лікувальний і профілактичний ефект. Важливою особливістю препарату є його здатність стимулювати утворення пізнього ІФН і підтримувати терапевтичні концентрації сироваткового ІФН впродовж тривалого часу [27-29].

Все вищезазначене обумовлює доцільність застосування аміксину як засобу імунотерапії хворих з меланомою з метою запобігання виникненню рецидивів та метастазів після видалення первинної пухлини. Метою роботи було дослідити вплив неоад’ювантного введення аміксину на показники протипухлинного імунітету прооперованих з приводу меланоми В-16 мишей C57BL.

Матеріали та методи дослідження

вверх

Дослідження проведені на мишах-самках лінії C57BL віком 2-2,5 міс (середня вага – 20-22 г). Утримання тварин та роботу з ними проводили у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил з біологічної етики та виконання робіт з експериментальними тваринами [30].

Для індукції пухлин використовували клітини меланоми В-16, отримані з Національного банку тканин людини і тварин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Штам підтримується пасажами на мишах C57BL/6. Для трансплантації використовували суспензію клітин, яку готували за методикою, що базується на попередній трипсинізації пухлини [31]. Пухлинні клітини трансплантували мишам у стопу правої задньої кінцівки в дозі 2,5 x 10⁵ клітин в об’ємі 0,05 мл за стандартною методикою.

В роботі використовували субстанцію аміксин, розроблену в Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богацького НАН України (м. Одеса). Досліджуваний препарат готували ex tempore і вводили тваринам per os у разовій дозі 0,06 мг/мишу (3 мг/кг) в неоад’ювантному режимі на 14-, 15- та 17-ту добу після перещеплення пухлин. Доза аміксину була підібрана та обґрунтована в наших дослідженнях на інтактних тваринах [32]. На 18-ту добу після перещеплення, коли первинна пухлина досягала 0,8 ± 0,2 см в діаметрі, проводили хірургічне видалення стопи з пухлиною під етамінал-натрієвим наркозом (40 мг/кг).

Було сформовано 3 групи: 1-ша – інтактні миші; 2-га – прооперовані миші, які не отримували аміксин (група «Контроль операції; КО»); 3-тя – миші, які отримували аміксин (група «Аміксин»). Імунологічне обстеження тварин проводили на 4-, 18-ту, 32-гу та 37-му добу після оперативного видалення пухлини.

Дослідження параметрів, що характеризують процес метастазування в легені, включало визначення частоти (відсоток мишей з метастазами) та інтенсивності метастазування (середня кількість метастазів на тварину), а також об’єму метастазів (в мм³). Додатково розраховували індекс інгібіції метастазування (ІІМ, %):

де ЧМ – частота метастазування у тварин групи «Аміксин»; ЧМ_К – частота метастазування у тварин групи КО; ІМ – інтенсивність метастазування у тварин групи «Аміксин»; ІМ_К – інтенсивність метастазування у тварин групи КО.

Імунологічні дослідження

Дослідження цитотоксичної активності природних кілерних клітин (ПКК), цитотоксичних лімфоцитів (ЦТЛ), макрофагів (МФ), сироватки крові (СК) визначали у МТТ-тесті. Клітинами-мішенями (КМ) виступали культура клітин К-562 (визначення цитотоксичності ПКК) або клітини меланоми В-16 (визначення цитотоксичності ЦТЛ, МФ, СК) [33].

В 96-лункові плоскодонні планшети вносили по 0,1 мл суспензії КМ у концентрації 2 х 10⁴ кл/лунку (2 х 10⁵ кл/мл) та 0,1 мл клітин-ефекторів (КЕ) у концентрації 1 х 10⁵ кл/лунку (1 х 10⁶ кл/мл). У контрольні лунки вносили 0,1 мл КМ або КЕ та додавали по 0,1 мл середовища. Планшети інкубували в термостаті протягом 18 год в умовах 5% СО₂, 100% вологості, за температури 37 °С. Після закінчення інкубації в лунки додавали 0,01 мл розчину МТТ (Sigma) в концентрації 5 мг/мл та інкубували протягом 4 год в умовах 5% СО₂, 100% вологості, за температури 37 °С.

Після закінчення інкубації планшети двічі відмивали фізіологічним розчином хлориду натрію та вносили в лунки 0,14 мл розчину диметилсульфоксиду (ДМСО). Вимірювали оптичну густину розчину при λ = 545 нм проти λ = 630 нм на автоматичному micro ELISA reader. Всі проби ставили у 3 паралелях. Індекс ЦТА (%) розраховували за формулою:

де ОГ_КЕ – оптична густина в контрольних лунках з КЕ; ОГ_КМ – оптична густина в контрольних лунках з КМ; ОГ_КЕ+КМ – оптична густина в дослідних лунках; ОГ_бланк – оптична густина в лунках, де було лише середовище культивування.

Рівні цитокінів (ІЛ-1, фактора некрозу пухлин (ФНП), ІФН-γ та ІЛ-10) в пг/мл визначали в СК та супернатантах (Сн) спленоцитів мишей за допомогою комерційних тест-систем BD OptEIA Set Mouse (BD Biosciences, США) згідно з інструкцією. Вимірювання оптичної густини проводили при λ = 450 нм проти λ = 570 нм на автоматичному рідері StatFax 2100 (США).

Статистична обробка результатів

Для проведення статистичної обробки результатів дослідження використовували програму StatSoft STATISTICA 7.0. Показники порівнювали з використанням t-критерію Стьюдента, статистично достовірною вважали різницю між показниками при р < 0,05 [34].

Результати дослідження та їх обговорення

вверх

Результати проведених досліджень показали, що застосування аміксину в неоад’ювантному режимі запобігало виникненню рецидивів та знижувало метастазування меланоми В-16 у оперованих тварин. За весь термін спостереження (до 37-ї доби після операції) в групі «Аміксин» рецидиви не виникли в жодної з тварин, тоді як у мишей контрольної групи – у 15% (табл. 1). На 37-му добу після видалення пухлини частота метастазування у мишей, яким вводили аміксин, була достовірно нижчою за показник групи «КО» (відповідно 14,3 проти 60,0%, р < 0,05). Також у групі «Аміксин» відмічали достовірне зменшення, порівняно з контрольними тваринами, кількості та об’єму метастазів – в 2,8 і 3,9 раза відповідно (р < 0,05). ІІМ становив 97,4% (див. табл. 1).

Таблиця 1. Особливості метастазування контрольних та дослідних мишей лінії C57BL/6 на 37-му добу після оперативного видалення меланоми В-16

Примітка: ¹ р < 0,05 порівняно з групою КО.

З метою визначення можливого механізму антиметастатичної дії аміксину було досліджено ЦТА ефекторів специфічної та неспецифічної ланок протипухлинного імунітету, а також вміст в СК та Сн спленоцитів експериментальних тварин ряду цитокінів.

Як видно з табл. 2, на 4-ту добу після операції у мишей групи «КО» ЦТА ПКК була суттєво нижча за показники інтактних тварин (р < 0,05). Застосування аміксину призводило до активації ЦТА ПКК в порівнянні як з інтактними, так і оперованими контрольними тваринами (31,2 ± 1,4 проти 19,5 ± 1,7 та 10,5 ± 1,4 відповідно, р < 0,05), яка зберігалася до 18-ї доби після операції. Починаючи з 32-ї доби ЦТА ПКК не відрізнялася від показника інтактних мишей. Тобто, доопераційне введення аміксину дало змогу підтримувати активність ПКК – одного з важливих ефекторів неспецифічного клітинного протипухлинного імунітету – на рівні інтактних тварин упродовж тривалого терміну спостереження.

У мишей групи «Аміксин» відмічали суттєве підвищення ЦТА ЦТЛ на 4-ту (порівняно з інтактними мишами і «КО») та 18-ту (порівняно з інтактними мишами) добу після оперативного видалення первинної пухлини (див. табл. 2). У віддалені терміни пухлинного процесу (на 37-му добу) ЦТА ЦТЛ наближалася до показника інтактних тварин.

Таблиця 2. Вплив аміксину на ЦТА ефекторів клітинного імунітету прооперованих з приводу меланоми В-16 мишей лінії С57BL

Примітка: ¹ р < 0,05 порівняно з інтактними мишами; ² р < 0,05 порівняно з групою КО.

Ще одним важливим показником, який характеризує неспецифічну ланку імунітету, є активність клітин моноцитарно-макрофагального ряду, до яких належать перитонеальні МФ. Доопераційне введення аміксину практично не впливало на показник клітинності останніх упродовж усього терміну спостереження. Статистично достовірне збільшення кількості перитонеальних МФ порівняно з інтактними мишами та групою «КО» відмічали лише на 32-гу добу після видалення пухлини (9,0 ± 1,3х10⁶ проти 4,0 ± 0,3х10⁶ та 3,9 ± 0,0х10⁶ відповідно, р < 0,05).

На відміну від клітинності, ЦТА МФ виявилась більш чутливою до впливу аміксину. Активність МФ у прооперованих мишей групи «Аміксин» суттєво перевищувала аналогічні показники тварин обох контрольних груп на 4-, 18-ту та 32-гу добу після оперативного видалення пухлини (див. табл. 2) та наближалася до рівня інтактних тварин у віддалені терміни пухлинного процесу. Тобто доопераційне застосування аміксину призводило до тривалої активації ЦТА перитонеальних МФ мишей, прооперованих з приводу меланоми В-16.

Результати дослідження ЦТА сироватки крові експериментальних тварин та її вплив на активність ЦТЛ та МФ наведені в таблиці 3. Відмічали поступове підвищення ЦТА СК у мишей, які отримували аміксин, з 8,9 ± 2,5% (на 4-ту добу) до 37,8 ± 3,5% (на 37-му добу; р < 0,05 порівняно з показниками обох контрольних груп). Додавання СК не чинило суттєвий вплив на ЦТА ЦТЛ мишей групи «Аміксин» протягом всього терміну спостереження, проте стимулювало ЦТА МФ у віддалені терміни (на 37-му добу після операції – в 1,3 раза порівняно з прооперованими контрольними мишами, р < 0,05).

Таблиця 3. Вплив СК прооперованих з приводу меланоми В-16 мишей лінії С57BL на ЦТА лімфоцитів селезінки

Примітка: ¹ р < 0,05 порівняно з інтактними мишами; ² р < 0,05 порівняно з групою КО.

Отримані результати дають змогу припустити, що активуючий вплив аміксину на активність ефекторів клітинного протипухлинного імунітету, вірогідно, обумовлений синтезом ендогенного ІФН у відповідь на введення препарату. Поява в системному кровотоці цього цитокіну забезпечує не лише активацію неспецифічної ланки імунітету, але й підтримує на рівні інтакт­них тварин специфічну імунну відповідь. Підтримка ЦТА досліджуваних клітин упродовж тривалого часу після застосування препарату може бути обумовлена тим, що ІФН в подальшому можуть продукувати вже самі активовані Т-лімфоцити, ПКК та МФ [35].

Для підтвердження такого припущення було проведене дослідження вмісту в СК або Сн спленоцитів експериментальних тварин деяких про- (ІФН-γ, ФНП) та протизапальних (ІЛ-4, ІЛ-10) цитокінів. Результати дослідження рівнів в СК інтактних та оперованих з приводу меланоми В-16 мишей ІЛ-4, ІЛ-10, ІФН-γ наведені в таблиці 4, значення співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 представлені на рисунку. Як видно, в СК інтактних тварин рівень ІФН-γ коливався в межах 90,6-116,3 пг/мл, ІЛ-4 – 7,0-32,7 пг/мл, ІЛ-10 – 20,8-82,5 пг/мл. При цьому співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 становило 11,4 ± 1,8 (7,0-14,3).

Таблиця 4. Рівень цитокінів ІЛ-4, ІЛ-10, ІФН-γ (в пг/мл) в СК оперованих з приводу меланоми В-16 мишей С57BL

Примітка: ¹ p < 0,05 – порівняно з інтактними тваринами; ² p < 0,05 – порівняно з групою КО.

У мишей, які не отримували аміксин, на 4-ту добу після видалення пухлини спостерігали достовірне збільшення рівня ІЛ-10 (у 5,5 раза, р < 0,05) і тенденцію до підвищення рівнів ІЛ-4 (в 1,1 раза) та ІФН-γ (в 2,6 раза) порівняно з показниками інтакт­них тварин, що, швидше за все, є реакцією організму на проведення оперативного втручання. При цьому співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 було на рівні інтакт­них тварин (див. рисунок). На 18-ту добу після операції рівні ІЛ-10 та ІЛ-4 знизилися, а рівень ІФН-γ збільшився і перевищував такий інтактних тварин у 3,6 раза. Співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 було вищим за показник інтактних тварин (хоча через гетерогенізацію показник не досягнув статистичної значущості), що свідчить про різкий зсув цитокинів в бік прозапальних. Надалі в контрольних оперованих мишей спостерігали значне зниження рівнів ІЛ-10 та ІФН-γ, співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 було достовірно нижче за показник інтактного контролю. Тобто, враховуючи наявність метастазів у легенях тварин цієї групи, можна припустити, що приблизно на 32-гу добу після операції відбулася маніфестація залишкової пухлинної хвороби.

Показники співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 у інтактних та оперованих з приводу меланоми В-16 мишей С57BL

 

Показники співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 у інтактних та оперованих з приводу меланоми В-16 мишей С57BL

Доопераційне застосування аміксину у мишей з меланомою В-16 призвело до дещо іншої, порівняно з тваринами групи «КО», «цитокінової» реакції на оперативне втручання. На 4-ту добу після операції у мишей групи «Аміксин» рівень протизапальних (ІЛ-4, ІЛ-10) цитокінів достовірно не відрізнявся від інтактних тварин та був нижчим за показники групи «КО», а рівень ІФН-γ перевищував такий інтактних тварин у 3,6 раза (р > 0,1; див. табл. 4). Співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 було вищим за показники обох контрольних груп, однак через гетерогенізацію не досягло достовірної різниці. Згодом відбувалося поступове зростання співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 порівняно як з інтактними, так і з контрольними оперованими мишами (див. рисунок). Превалювання в СК ІФН-γ, за даними літератури [36], вказує на спрямованість формування імунних реакцій за Тh1-типом з наступним розвитком клітинних протипухлинних реакцій на пізніх стадіях пухлинного процесу.

Оцінку стану моноцитарно-макрофагальної системи доповнюють і результати визначення рівнів ФНП та ІЛ-1β в Сн спленоцитів інтактних та оперованих мишей, які наведені в таблиці 5. Як видно, у оперованих контрольних мишей достовірне зниження рівня ІЛ-1β (р < 0,05 порівняно з інтактним контролем) спостерігали на 4-ту добу після операції; надалі цей показник не мав достовірних відмінностей від інтактного контролю. Рівень ФНП у групі «КО» не відрізнявся від такого в інтактних мишей протягом майже всього терміну спостереження (див. табл. 5).

Таблиця 5. Вміст ІЛ-1 та ФНП (в пг/мл) в Сн спленоцитів оперованих з приводу меланоми В-16 мишей С57BL

Примітка: ¹ p < 0,05 – порівняно з інтактними тваринами; ² p < 0,05 – порівняно з групою КО.

Після застосування аміксину спостерігали поступове підвищення рівня ІЛ-1, статистично достовірне на 32-гу добу після операції порівняно з показниками як інтактних, так і оперованих контрольних мишей (у 1,8 та 2,0 раза відповідно). Дещо подібні зміни були виявлені при дослідженні рівня ФНП, який на 4-ту добу після операції був достовірно нижчий за показник групи «КО», однак потім відбувалося його поступове зростання, статистично достовірне на 32-гу та 37-му добу (див. табл. 5). Зазначена динаміка змін вмісту ФНП та ІЛ-1β в Сн спленоцитів мишей, які отримували аміксин, можливо, і обумовлює підвищення ЦТА перитонеальних МФ та чинить потенціюючий вплив СК на таку активність.

Таким чином, аналіз отриманих в ході дослідження даних дає змогу припустити, що триразове введення мишам аміксину до видалення пухлини зменшувало негативний вплив оперативного втручання на стан імунної системи. Про це свідчить достовірно нижчий, порівняно з контрольними мишами, рівень ІЛ-10 та ІЛ-4 з одночасним підвищенням вмісту ІФН-γ в СК на 4-ту добу після операції. Такий цитокіновий фон, швидше за все, зумовив в подальшому (32-га доба після операції) більш збалансований вміст цих цитокінів в СК та забезпечив спрямованість імунної відповіді за Тh1-типом, для якого характерним є збільшення співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4.

Цей тип клітинної відповіді відіграє значну роль в протипухлинному імунітеті за рахунок продукції переважно ІФН-γ та наступної активації цитотоксичних і фагоцитуюючих властивостей МФ. Про активацію та збереження у оперованих мишей, яким вводили аміксин, активності клітин моноцитарно-макрофагального ряду на пізніх стадіях пухлинного процесу свідчать достовірно підвищені рівні ІЛ-1 та ФНП. Результати наших досліджень добре узгоджуються з даними літератури про активуючий вплив аміксину на активність МФ та ПКК [37, 38].

Висновки

вверх

1. Триразове введення мишам аміксину в неоад’ювантному режимі призводило до зменшення частоти виникнення рецидивів та метастазів після оперативного видалення меланоми В-16. ІІМ становив 97,4%.

2. Доопераційне застосування аміксину сприяло збереженню функціональної активності ефекторів як неспецифічної (ПКК, МФ), так і специфічної (ЦТЛ) ланок протипухлинного імунітету протягом всього періоду спостереження (у тому числі у віддалені терміни пухлинного процесу).

3. Застосування аміксину зменшувало прояви імуносупресії в ранній післяопераційний період: суттєво підвищувалась ЦТА ПКК, МФ і ЦТЛ порівняно з показниками обох контрольних груп (p < 0,05), вміст ІЛ-10 та ІЛ-4 в СК зберігався на рівні інтактного конт­ролю.

4. На пізніх етапах спостереження наслідком доопераційного застосування аміксину була спрямованість формування імунної відповіді за Тh1-типом: співвідношення ІФН-γ/ІЛ-4 у мишей групи «Аміксин» перевищувало показник оперованих контрольних мишей у 3,4 (на 32-гу добу, р < 0,05) та 4,8 (на 37-му добу, p > 0,1) раза.

Література

1. Wang E., Miller L.D., Ohnmacht G.A. et al. (2002) Prospective molecular profiling of subcutaneous melanoma metastases suggests classifiers of immune responsiveness. Cancer Res., 62: 3581-3586.

2. Galon J., Costes A., Sanchez-Cabo F. et al. (2006) Type, density and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science, 313: 1960-1964.

3. Ascierto M.L., De Giorgi V., Liu Q. et al. (2011) An immunologic portrait of cancer. J. Translat. Med., 9: 146-159.

4. Harlin H., Meng Y., Peterson A.C. et al. (2009) Chemokine expression in melanoma metastases associated with CD8+ T-cell recruitment. Cancer Res., 69: 3077-3085.

5. Фильчаков Ф.В., Грабовой А.Н., Лен А.Д. и др. (2014) Локальный иммунный ответ у больных меланомой кожи: связь с эффективностью интерферонотерапии. Клин. онкол., 4(16): 12-16.

6. Gyorki DE, Callahan M, Wolchok JD, Ariyan CE. The delicate balance of melanoma immunotherapy. Clin Transl Immunol 2013; 2: e5. doi:10.1038/cti.2013.5.

7. Zikich D., Schachter J., Besser M.J. (2013) Immunotherapy for the management of advanced melanoma: the next steps. Am. J. Clin. Dermatol., 4: 261-272.

8. Kirkwood J.M., Tarhini A.A., Panelli M.C. et al. (2008) Next generation of immunotherapy for melanoma. J. Clin. Oncol., 26(20): 3445-3455.

9. Kalani A.D., Jack A., Montenegro G. et al. (2008) Immunotherapy as an adjuvant therapy in the management of advanced, surgically resected, melanoma. G. Ital. Dermatol. Venereol., 43(1): 59-70.

10. Verdegaal E.M., Visser M., Ramwadhdoebe T.H. et al. (2011) Successful treatment of metastatic melanoma by adoptive transfer of blood-derived polyclonal tumor-specific CD4+ and CD8+ T-cells in combination with low-dose interferon-alpha. Cancer Immunol. Immunother., 60: 953-963.

11. Фильчаков Ф.В., Коровин С.И. (2012) Современные подходы к адоптивной иммунотерапии больных генерализованной меланомой кожи (обзор литературы). Клиническая онкология, 6(2): 124-128.

12. Dharmadhikari N., Mehnert J.M., Kaufman H.L. (2015) Oncolytic virus immunotherapy for melanoma. Curr. Treat. Options Oncol., 16(3): 326.

13. Sivendran S., Pan M., Kaufman H.L., Saenger Y. (2010) Herpes simplex virus oncolytic vaccine therapy in melanoma. Expert Opin. Biol. Ther., 10(7): 1145-1153.

14. Mansh M. (2011) Ipilimumab and Cancer Immunotherapy: A New Hope for Advanced Stage Melanoma. Yale J. Biol. Med., 84(4): 381-389.

15. Wang T., Somasundaram R., Herlyn M. (2013) Combination Therapy of Immunocytokines with Ipilimumab: A Cure for Melanoma? J. of Invest. Dermatol., 133: 595-596.

16. Kalaaji A.N. (2007) Cytokine therapy in advanced melanoma. J Drugs Dermatol., 6(4): 374-378.

17. Коровин С.И. (2008) Цитокины в лечении больных с меланомой кожи. Онкология, 10(3): 354-358.

18. Hauschild A., Weichenthal M., Rass K. (2010) Efficacy of low-dose interferon {alpha}2a 18 versus 60 months of treatment in patients with primary melanoma of ≥1.5 mm tumor thickness: results of a randomized phase III DeCOG trial. J. Clin. Oncol., 28: 841-846.

19. Коровін С.І., Фільчаков Ф.В., Шуміліна К.С. та ін. (2011) Вплив різних схем інтерферонотерапії на функціональну активність лімфоцитів у хворих на меланому шкіри. Імунол. та алергол.: наука та практика, 2: 120-125.

20. Spitler L.E. (2002) Adjuvant therapy of melanoma. Oncology (Williston Park), 16: 7-9.

21. Verma S., Quirt I., McCready D. et al. (2006) Systematic review of systemic adjuvant therapy for patients at high risk for recurrent melanoma. Cancer, 106(7): 1431-1442.

22. Minutilli E., Feliciani C. (2012) Adjuvant therapy for resected stage III melanoma patients: high-dose interferon-alpha versus ipilimumab combined with kinases inhibitors. Tumori, 98(2): 185-90.

23. Eggermont A.M., Suciu S., Testori A. et al. (2012) Ulceration and stage are predictive of interferon efficacy in melanoma: results of the phase III adjuvant trials EORTC 18952 and EORTC 18991. Eur. J. Cancer., 48(2): 218-25.

24. Mocellin S., Lens M.B., Pasquali S. et al. (2013) Interferon alpha for the adjuvant treatment of cutaneous melanoma. Cochrane Database Syst Rev. 18; 6:CD008955.

25. Андронати С.А., Литвинова Л.А., Головенко Н.Я. (1999) Пероральный индуктор эндогенного интерферона амиксин и его аналоги. Журн. Акад. мед. наук Украины, 5(1): 53-66.

26. Співак М.Я., Андронаті С.А., Ляхов С.А. та ін. (2007) Індуктори інтерферону як противірусні агенти: нові аспекти старої проблеми. Журнал орг. та фарм. хімії, 1(17): 4-20.

27. Касихина Е.И. (2012) Клиническое применение тилорона дигидрохлорида: возможности и перспективы. Клин. дерматол. венерол., 2: 66-74.

28. Селькова Е.П., Семененко Т.А., Носик Н.Н. и др. (2001) Влияние амиксина – отечественного аналога тилорона – на показатели интерферонового и иммунного статуса человека. Журн. микробиол., 4: 31-35.

29. Лісяний М.І., Скітяк С.А. (2002) Застосування аміксину в комплексному лікуванні гліом головного мозку. Лікар. справа, 8: 121-123.

30. Кожем’якін Ю.М., Хромов О.С., Філоненко М.А., Сайфетдінова Г.А. Науково-практичні рекомендації з утримання лабораторних тварин та роботи з ними. Київ 2002, 179 с.

31. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США (1980) / Под ред. Софьиной З.П., Сыркина А.В. М: Медицина: 79.

32. Воєйкова І.М., Федосова Н.І., Караман О.М. та ін. (2015) Вплив різних доз низькомолекулярного індуктора ендогенного інтерферону на клітинну та гуморальну ланки системи імунітету у мишей лінії C57Bl/6. Клін. імунол. Алергол. Інфектол., 7(86): 46-53.

33. Mosmann T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, 65: 55-63.

34. Сиденко А.В., Вишняков В.В., Исаев С.М. (2011) Теория статистики. Учебник. М: МАКС-Пресс, 343 с.

35. Сологуб Т.В., Ледванов М.Ю., Малый В.П., и др. (2009) Иммунный ответ при вирусных инфекциях. Успехи современного естествознания, 12: 29-33.

36. Ubukata H., Motohashi G., Tabuchi T. et al. (2010) Evaluations of interferon-gamma/interleukin-4 ratio and neutrophil/lymphocyte ratio as prognostic indicators in gastric cancer patients. J. Surg. Oncol., 102: 742-747.

37. Algara I., Gonzalez A., Perez M. et al. (1996) Effect of in vivo activation of natural killer (NK) cell by a tilorone analogue on the survival of mice injected intravenously with different experimental murine tumours. Clin. Exp. Immunol., 103(3): 499-505.

38. Gaforio J.J., Ortega E., Algarra I. et al. (2002) NK cell mediate increase of phagocytic activity but not of proinflammatory cytokine (interleukin-6 [IL-6], tumor necrosis factor alpha, and IL-12) production elicieted in splenic macrophages by tilorone treatment of mice during acute systemic candidiasis. Clin Diagn Lab Immunol, 9(6): 1282-1294.