Молекулярные подходы в диагностике первичных иммунодефицитов

Проблема точной диагностики первичных иммунодефицитов (ПИ), поднятая в предыдущих публикациях, состоит из нескольких компонентов, одним из которых является сложность понимания методических подходов, применяемых на со­временном этапе. Современные специалисты в области клинической иммунологии (иммунологи, педиатры, аллергологи и др.) должны сегодня владеть азами молекулярной биологии и генетики, чтобы ясно понимать сущность ПИ и уметь не только клинически заподозрить наличие генетического дефекта, но и грамотно определить диагностическую тактику. Именно этой части проблемы диагностики ПИ и посвящена данная публикация.

Классические подходы к диагностике ПИ

    Установление диагноза ПИ у лиц с частыми повторными инфекциями, которые являются индикаторами данного состояния, обычно включает в себя оценку состояния лейкоцитов крови, их количественную характеристику и функциональный анализ. Если основные популяции лейкоцитов находятся в пределах нормы, дифференциальный подсчет позволяет выявить имею­щиеся нарушения. Сочетание подсчета с использованием проточной цитометрии позволяет определить соотношение индивидуальных клеточных популяций [6]. Например, поверхностная экспрессия CD40-лиганда (CD40L) снижена или отсутствует при Х-сцепленном синдроме гипериммуноглобулинемии М (гипер-IgМ).
    При применении проточной цитометрии следует иметь в виду, что поверхностные белки клетки могут быть мутантными. При этом их экспрессия не нарушается, и это может привести к ошибочному выводу, что нормальная экспрессия отражает нормальность, а не мутантность белков. Замены аминокислот у мутантных белков могут наблюдаться в цитоплазматических доменах. При этом рецептор становится нефункционирующим. Также мутации могут происходить и во внеклеточных доменах рецептора. Проточная цитометрия не в состоянии выявить эти изменения, и диагноз должен дополняться функциональными тестами. Например, для гипер-IgМ-синдрома это отсутствие продукции in vitro IgМ после сшивания CD40L.
    Для выявления наличия или отсутствия белков может также применяться Western-блоттинг. Это обусловливает его использование в диагностике ПИ. Уровень концентрации белков может позволять идентифицировать отдельные варианты ПИ. Например, Х-сцепленная хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ) существует в трех вариантных формах. Мутации в гене CYBB, который кодирует gp91^phox, могут приводить к тому, что в нейтрофилах белок либо будет присутствовать, не являясь при этом функциональным, либо нет, или будет наблюдаться сниженное его количество [14].
    При тяжелых иммунодефицитах, таких как тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД), отдельные клеточные популяции могут отсутствовать или иметь существенно сниженный уровень. Например, значительное уменьшение количества циркулирую­щих Т-лимфоцитов, нарушенная пролиферация лимфоцитов, аномалии лицевого черепа и отсутствие тени тимуса являются критериями синдрома Ди Джорджи. Обычно у всех пациентов с повторяющимися бактериальными инфекциями измеряется уровень сывороточных иммуноглобулинов и комплемента с помощью нефелометрии или иммуноферментного метода (ИФА) [4].
    Оценка функционального ответа клеток дает дополнительную информацию о состоянии отдельных популяций лейкоцитов. Например, пролиферация Т- и В-лимфоцитов оценивается в процессе ответа на митогены либо антигены, нейтрофилов – по способности к миграции и продукции активных форм кислорода, бактерицидности и фунгицидности. Каждое из этих исследований позволяет врачу заподозрить заболевание и направляет на тот ген/гены, который должен быть оценен.

Молекулярные подходы к диагностике ПИ

Базы данных ПИ
На сегодняшний день наблюдается значительный прогресс в определении молекулярных основ многих описанных ПИ. Так, доступными являются специальные базы данных, которые могут помочь в диагностике ПИ (табл. 1).
    Эти ресурсы в соответствии с группами и отдельными заболеваниями включают виды и спектр мутаций. Кроме того, имеются соответствующие публикации о диагностике отдельных заболеваний, которые могут быть начальной точкой в анализе интересующих генов. Используемые технологии скрининга позволяют быстро определить дефект и обосновать диагностический процесс. Предполагается, что определение мутаций для таких заболеваний должно начинаться с секвенирования кДНК (комплементарной ДНК) исследуемого гена с последующим секвенированием соответствующего геномного экзона, так как многие скрининговые технологии не обеспечивают 100% чувствительности [2].
Скрининговые методы
    Существует две основные стратегии выявления мутаций: предварительно хорошо охарактеризованные (вариации последовательностей) и с неохарактеризованными последовательностями.
    Примером является детекция специфических мутаций в гене MASP-2, который регулирует сывороточные уровни маннозосвязывающего лектинового белка (MASP). Уровни этого белка модулируются тремя известыми вариантными последовательностями, кластеризированными в 1 экзоне. Таким образом, пациенты с низким уровнем MASP или его отсутствием должны быть скринированы на наличие этих трех вариаций. Однако для большинства генов поиск предварительно охарактеризованных вариантов последовательностей неприемлем, так как «горячие точки» мутаций не одинаковы для разных индивидуумов. Например, Х-сцепленная ХГБ преимущественно вызвана мутациями в белке gp91^phox. Как видно из рис. 1, аминокислотные замены идентифицируются в различных областях белка без каких-либо «горячих точек».
    Такая ситуация является общей для многих заболеваний, при которых пациенты не имеют уникальной мутации/мутаций. В таких случаях лаборатории должны прицельно исследовать интересующий ген, чтобы установить природу и расположение мутации, приведшей к развитию заболевания. Так как обычный размер гена составляет 10-15 кб и число экзонов на 1 ген достигает 9 [16], то для быстрой идентификации продуктов, в которых возможны мутации, могут быть использованы следующие технологии сканирования мутаций:
• одноцепочечный конформационный полиморфизм SSCP (single-stranded conformation polymorphism);
• гетеродуплексный анализ HA (heteroduplex ana­lysis);
• денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография dHPLC (denaturing high-perfomance liquid chromatography);
• денатурирующий градиентный гель-электрофорез DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis);
• гель-электрофорез с градиентом температуры TGGE (temperature gradient gel electrophoresis);
• конформационно-чувствительный гель-электро­форез CSGE (conformation-sensitive gradient electro­phoresis).
    После идентификации продукта, в котором может быть мутация, проводится установление точных генетических изменений.
    В настоящее время 92% мутаций, вызывающих развитие заболеваний, представлены микроповреждениями (миссенс/нонсенс, сплайсинговые, регуляторные, малые делеции и вставки), 8% – составляют макроповреждения (повторяющиеся варианты, большие вставки/удвоения, комплексные реаранжировки и большие делеции) [18]. Все эти нарушения могут быть выявлены с помощью перечисленных выше технологий.
    Все технологии скрининга нуждаются в предварительной амплификации интересующего гена с помощью ПЦР. Индивидуальные экзон/экзоны амплифицируются или как один продукт, или, если индивидуальные экзоны очень велики, как меньшие перекрываю­щиеся фрагменты, после чего эти продукты подвергаются скринингу на предмет присутствия мутаций. Выбор того или иного подхода/технологии зависит от преимуществ и недостатков применяемых методов (табл. 2).
Анализ кДНК
    Практически все исследования по установлению мутаций при ПИ начинаются с изучения геномной ДНК с использованием скрининговых технологий. Предполагается, что прямое секвенирование кДНК является эффективным подходом к идентификации большинства патогенных мутаций. Так как клетки крови для анализа получить легко, это облегчает процесс выделения РНК. Стоимость, определяемая затраченным временем и реагентами, является важнейшим ограничиваю­щим фактором секвенирования многоэкзонных генов без предварительного скринингового подхода. Например, CYBB-ген содержит 12 экзонов [15] и требует 24 праймера для амплификации. Каждый экзон должен быть секвенирован в двух направлениях, чтобы подтвердить определение последовательности. Таким образом, необходимы, по крайней мере, 24 реакции, чтобы установить полную последовательность гена. Если номинальная стоимость определения последовательности составляет 10 долларов США за образец, то для полного анализа одного гена необходимо потратить 240 долларов США. Следует заметить, что данный расчет приведен для рутинного определения последовательности в США и Австралии, в Украине такое определение будет стоить намного дороже.
    Примером такого подхода может служить исследование M. Costabile и соавт. [2], в котором была получена кДНК из клеток пациента и с помощью перекрывающихся пар праймеров амплифицирована и секвенирована полная кДНК (рис. 2).
    Обнаруженная мутация была подтверждена в последовательности соответствующего экзона, что доказало ее наличие на геномном уровне.
    Недостатком этого подхода является необходимость наличия большого количества мРНК у пациента. Некоторые мутации могут снижать продукцию и/или стабильность мРНК и таким образом ограничивать эффективность такого подхода. Однако чувствительность обратной транскриптазной ПЦР такова, что даже малых количеств мРНК может быть достаточно для превращения в кДНК. Там, где не обнаруживается мРНК, должна быть изучена непосредственно ДНК. Кроме того, некоторые патогенные мутации могут быть найдены в интронных последовательностях, которые могут быть потеряны при анализе только кДНК. Тем не менее, такие мутации наблюдаются достаточно редко, основная масса патогенных мутаций встречается в кодирующих областях.
    За последние десятилетия методики определения последовательностей существенно улучшились, автоматизировались, упростились для пользователя, а 96-капиллярные приборы позволяют быстро скринировать образцы. Так как многие ПИ достаточно редки, то загрузка диагностической лаборатории не должна быть избыточной и ограничивать применение данного подхода.
Одноцепочечный конформационный полиморфизм (ОЦКП; Single-Stranded Conformation Polymorphism SSCP)
    ОЦКП представлял собой наиболее широко использовавшуюся технологию секвенирования для выявления мутаций, с тех пор как впервые был предложен Orita с соавт. в 1989 г. [12], в том числе и для выявления мутаций, вызывающих ПИ. Этот метод был использован для установления мутаций при болезни Брутона, хронической гранулематозной болезни, синдроме Вискотта – Олдрича.
    ОЦКП заключается в ПЦР-амплификации интересующего гена, который затем денатурируется под воздействием тепла и формамида для образования одноцепочечной ДНК (оцДНК) [10]. Фрагменты после этого разделяются неденатурирующим электрофорезом. Во время электрофореза оцДНК образуют нуклеотидные конформации, зависящие от последовательностей нуклеотидов. Такая форма конформаций определяет скорость движения оцДНК в геле. Большинство изменений оснований будет нарушать физическую конформацию ДНК, достаточную для того, чтобы определить ее как разницу в электрофоретической подвижности.
    Этот метод широко используется в практике, благодаря невысокой стоимости, применению обычного оборудования и реагентов, достаточной чувствительности. ОЦКП может проводиться без использования радиоактивных меток, но тогда необходимо применение высокочувствительных систем детекции малых количеств ДНК. Использование этидиума бромида и метода серебрения отличается малой чувствительностью, поэтому в последнее время все большее распространение приобретает окрашивание флуоресцентными красителями, как, например, SYBR-зеленый.
    Наибольшим недостатком этого метода является достаточно низкая чувствительность – от 50 до 97% (при использовании капиллярного электрофореза). При этом ложноотрицательные результаты могут катастрофически сказываться на лечении пациентов.
    Размер продуктов ПЦР прямо определяет чувствительность анализа. Например, 97% мутаций, присут­ствующих в генах в-глобина, р53 и родопсина, идентифицировались при размере ПЦР-продуктов 155 п. о. Чувствительность снижалась до 78%, когда размеры продуктов составляли 135 п. о., и возрастала, если фрагменты были больше 155 п. о.
    На чувствительность метода может влиять множество факторов:
• гелевая матрица;
• условия электрофореза;
• состав буфера;
• концентрация ДНК, глицерина;
• постоянство температуры во время фореза;
• расположение вариационной последовательности [1].
    Считается, что до 90% мутаций можно определить во фрагментах размером до 200 п. о., варьируя эти условия. Уровень детекции снижается до 80%, если размер фрагментов увеличивается до 350 п. о.
    Продукты, имеющие размер свыше 1 000 п. о., сначала могут быть разрезаны на фрагменты с помощью подходящих ферментов, а затем исследованы с помощью ОЦКП. Такое добавление дополнительного этапа повышает стоимость процедуры и усложняет ее проведение. Выбор ферментов для рестрикции также может влиять на чувствительность реакции.
    К сожалению, невозможно предсказать, как будет двигаться в электрическом поле та или иная измененная последовательность. Многое зависит от эмпирической оптимизации. Плохая стандартизация метода усложняет интерпретацию подвижности молекул в плане их состава, увеличивая частоту как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов.
    Гетеродуплексный анализ (Heteroduplex Analysis)
    Гетеродуплексный анализ (ГА) зависит от конформации удвоенной ДНК, разделяемой в нативном полиакриламидном геле. Аплифицированная в ПЦР ДНК будет состоять или из двух комплементарных цепей, или из цепей, которые имеют несовпадения в одной паре. Несовпадающие ДНК будут формировать гетеродуплексы, имеющие меньшую электрофоретическую подвижность по сравнению с гомодуплексами. Фрагменты с нарушенной подвижностью затем секвенируются.
    Нуклеотидное несовпадение представляет собой принципиальный фактор, влияющий на разделение гомо- и гетеродуплексов. Например, несовпадение G:G/C:C легче обнаруживается, чем А:А/Т:Т. ГА технически прост и имеет низкую стоимость, по уровню чувствительности сравним с ОЦКП, требует значительной оптимизации, в ряде случаев может сочетаться с ОЦКП для повышения чувствительности, хотя это приводит к дополнительным трудозатратам.
    Факторами, влияющими на чувствительность ГА, являются электрофоретические условия, тип замены основания, последовательность, в которой произошла замена, содержание в фрагменте GC, размер фрагмента (оптимальный размер – 200-600 п. о.) [8].
    Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (дВЭЖХ)
    дВЭЖХ представляет собой анализ ПЦР-продуктов с помощью ионпарной обращенно-фазовой хроматографии на колонках, содержащих алкилированные непористые частицы [11]. При применении градиента ацетонитрила и частичной тепловой денатурации гетеродуплексы демонстрируют повышенное время удерживания по сравнению с гомодуплексами «дикого» типа.
    Чувствительность дВЭЖХ существенно не меняется при размерах фрагментов от 150 до 700 п. о. в случае прекрасной специфичности. Например, было охарактеризовано 100% мутаций в гене ІХ фактора свертывания крови и гене нейрофиброматоза 1 типа. Для сравнения: с помощью ОЦКП было охарактеризовано только 50% мутаций. Важным является тот факт, что сегодня существуют компьютерные программы, которые могут предсказывать соответствующие условия (температура, концентрация ацетонитрила) для определенных нуклеотидных последовательностей при определении гетеродуплексов.
    Недостатком метода является необходимость специального оборудования. Также сложно анализировать гетерозиготы.
    Конформационно-чувствительный, денатурирующий градиентный и температурно-градиентный гель-электрофорез (КЧГЭ, ДГГЭ и ТГГЭ)
    КЧГЭ, ДГГЭ и ТГГЭ заключаются в анализе амплифицированной с помощью ПЦР двухцепочечной ДНК в градиенте денатурирующего агента (мочевина или формамид) (ДГГЭ), в градиенте температуры (ТГГЭ) или вовсе без градиента (КЧГЭ). Гетеро- и гомодуплексы разделяются в соответствии с характеристиками плавления, изменяющимися вследствие несовпадения их последовательностей. В ДГГЭ концентрация денатурирующего агента, а в ТГГЭ – уровень температуры возрастают. В момент начала денатурации ДНК ее подвижность падает. КЧГЭ представляет собой дальнейшее развитие метода ГА с использованием модифицированного полиакриламидного геля для отделения гетеро- и гомодуплексов. Простота проведения, использование рутинного лабораторного анализа, применение продуктов ПЦР без дальнейших манипуляций являются основными преимуществами подхода. Недостатки заключаются в необходимости доступа к ДНК-секвенатору, высокой стоимости синтеза флуоресцентных праймеров, необходимости специальных навыков в анализе данных.
    Основной недостаток ДГГЭ состоит в необходимости приготовления градиентного денатурирующего геля. Из-за сложности его стандартизации чувствительность метода может несколько снижаться. ТГГЭ характеризуется большей воспроизводимостью, меньшими трудозатратами. Все перечисленные методы определяют различия в подвижности и, соответственно, позволяют анализировать фрагменты с размером до 1 000 п. о. [5].
Прямое секвенирование
    Существует только один способ точного определения генетических мутаций – секвенирование целого гена. Для этого используют два метода: дидезокси-окончание цепи [17] и пиросеквенирование [13].
Дидезокси-окончание цепи
    Секвенирование путем дидезокси-окончания цепи основано на синтезе ДНК, который происходит в присутствии смеси дезокси- и дидезоксинуклеотидов (ддНТФ). Когда ддНТФ случайно включаются в растущую цепь ДНК, они приводят к появлению амплифицированных продуктов с окончаниями различной длины. Такие предварительно оконченные фрагменты анализируются с помощью электрофореза и регистрируются вручную, или, если ддНТФ соединены с флуорохромом, автоматически методом капиллярного электрофореза.

    Основной недостаток метода заключается в его стоимости. Однако применение новых флуорохромных технологий существенно ее снижает. Все меньшие количества метки применяются для определения последовательности образца. Секвенирование может сочетаться с технологиями скрининга. Однако недостаток лабораторий, имеющих соответствующее оборудование, сущест­венно ограничивает применение этого подхода.
    Как и при применении других методов, возможно получение ложно-положительных вариаций последовательностей исследуемого гена во время ПЦР-амплификации. Риск подобной ошибки снижается при использовании доступных сегодня полимераз, отличающихся высоким качеством считывания и низкой частотой ошибок. В дополнение к этому мутации в продуктах ПЦР должны быть подтверждены альтернативными методами: рестрикционным ферментативным анализом или аллель-специфичной ПЦР.
Пиросеквенирование
    Пиросеквенирование представляет собой метод определения высвобождающейся в ходе синтеза ДНК молекулы пирофосфата [13]. В результате серии четырех ферментативных реакций образуется видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству включенных в цепь нуклеотидов. Каскад начинается с реакции полимеризации нуклеиновой кислоты, в которой высвобождается неорганический пирофосфат в результате включения нуклеотидов в цепь ДНК-полимеразой. Высвобожденный пирофосфат превращается затем в АТФ, который способствует свечению. Так как нуклеотиды добавляются пошагово, а их последовательность известна, можно определить их последовательность и в матрице.
    Применение этой технологии способствует определению последовательности бактериального генома в течение 4 ч, а также ОНП маннозосвязывающего лектина.
    Наибольшим недостатком пиросеквенирования является ограниченная длина чтения, используемая для определения мутаций. Необходима высокая эффективность работы четырех ферментов, принимающих участие в реакции. Ферментативная активность со временем снижается, поэтому разведение образца может снижать активность ферментов и негативно влиять на длину прочитанного фрагмента.
Комбинаторное секвенирование путем гибридизации (КСПГ)
    Ресеквенирование представляет собой определение последовательности ДНК, которая предварительно уже была охарактеризована. Проводится оно с помощью стандартных методов определения последовательностей. В последнее время для ресеквенирования генов и геномов используются новые технологии, одной из которых является КСПГ [3].
    Сущность КСПГ состоит в том, что универсальная проба прикреплена к стеклянной пластинке, а флуоресцентно-меченая свободно находится в растворе. Немеченая амплифицированная в ПЦР ДНК смешивается с ДНК-лигазой и меченой пробой в растворе. При этом происходит гибридизация с пробой, прикрепленной к стеклянной пластинке. Когда обе пробы гибридизируются с исследуемой ДНК в прилегающих комплементарных положениях, они ковалентно сшиваются ДНК-лигазой, образуя одну длинную меченую пробу, прикрепленную к твердой фазе.
    Такой подход был применен для определения по­следовательности гена АРС, вызывающего аутосомно-доминантную форму колоректального рака. Для этого было скринировано 23 пациента с семейным аденоматозным полипозом. Были секвенированы фрагменты с максимальной длиной чтения 36 000 п. о., точность определения при этом составила 99,97%. Метод позволяет подтвердить замены оснований, вставки, малые делеции у всех пациентов.
Олигонуклеотидные чипы для ресеквенирования
    Олигонуклеотидные чипы для ресеквенирования основаны на гибридизации фрагментов ДНК с мечеными концами с набором перекрывающихся олигонуклеотидных 25-мерных проб. Для каждого исследуемого основания применяются четыре пробы: одна представляет собой референтную последовательность, остальные три варьируют на центральном основании с одним из трех нуклеотидов [7]. Пробы, соответствующие обеим смысловым и антисмысловым цепям, синтезируются на чипе и анализируются по интенсивности сигналов от проб, различных для гетеро- и гомозигот. Несовпадение среднего основания будет уменьшать или устранять связывание меченой мишени и таким образом приводить к снижению интенсивности гибридизационного сигнала. В настоящее время готовые ресеквенирующие чипы можно приобрести у фирмы Affymetrix (Санта-Клара, Калифорния; www.affymetrix.com).
    С использованием этой системы был скринирован ген атаксии-телеангиэктазии на наличие возможных мутаций. 94,4% различных гетерозиготных и 100% гомозиготных вариантов последовательностей было выявлено при помощи этого метода при всего пяти ложноположительных результатах. Затем эта технология была применена для определения малых вставок и делеций (даже размером в одно основание).
    Ресеквенирующие чипы использовались для детекции вариационных последовательностей в гене множественного аутосомно-рецессивного заболевания сетчатки и опухольассоциированных генов. В 2004 г. эта технология позволила секвенировать геном вируса тяжелого острого дыхательного синдрома (SARS), а также идентифицировать новые варианты вируса.
    Наибольшим преимуществом метода является отсутствие необходимости предварительно знать вариацию в участке гена. Один анализ позволяет установить ОНП. Недостатком метода является особый состав проб, а также то, что метод не применим для установления новых последовательностей или реаранжировки последовательностей в образце.
Выявление ОНП
    Как указывалось выше, некоторые заболевания связаны с набором хорошо определенных мутаций, например белка MASP. В таких случаях можно использовать выявление ОНП. Примером таких методов может являться одно-нуклеотидное удлинение (ОНУ) и анализ олигонуклеотидной лигации (АОЛ) (SNPlex).
    При ОНУ разрабатываются праймеры для отжига 3’конца к интересующему полиморфному участку, после чего ДНК-полимераза удлиняет праймер одним меченым нуклеотидом, комплементарным к нуклеотиду вариантного участка. Меченый продукт после этого может быть детектирован с помощью капиллярного электрофореза. Данный подход позволяет с высокой специфичностью выявлять ОНП [9].
    SNPlex является модификацией АОЛ, выпускаемой Applied Biosystem, в которой олигонуклеотидная лигация/ПЦР сочетается с капиллярным электрофорезом для анализа биаллельных ОНП генотипов. Во время анализа аллель-специфичные олигонуклеотидные пробы (АСО) и локус-специфичные олигонуклеотидные пробы (ЛСО) гибридизируются к последовательности мишени. Эти два олигонуклеотида присоединяются в том случае, если совпадает последовательность в участке ОНП. В то же время, универсальные линкеры лигируются к дистальным концам проб. Линкеры содержат обе универсальные праймерсвязывающие последовательности, так же как и последовательности, комплементарные для АСО и ЛСО. Несвязанные пробы, линкеры и геномная ДНК удаляются путем ферментативного разрушения, после чего очищенные лигазные продукты амплифицируются с помощью набора универсальных праймеров, один из которых биотинилирован. Биотинилированные ампликоны затем связываются со стрептавидином. Флуоресцентномеченые универсальные пробы присоединяются к уникальным 5’концам, после чего разделяются с помощью капиллярного электрофореза.

Заключение

    При установлении диагноза первичных иммунодефицитных заболеваний в настоящее время необходимо использовать комбинацию клеточных, иммунохимиче­ских и молекулярно-биологических подходов. Методы с применением клеточных технологий позволяют оценить проявления фенотипа, в то время как молекулярные подходы дают возможность получить конкретную информацию о происхождении иммунодефицита.
    Несомненным успехом последних лет явилось развитие и широкое применение технологий выявления мутаций, обеспечивающих молекулярную диаг­ностику ПИ. Несмотря на это, из-за недостаточной чувствительности указанных технологий иногда возможно получение ложноотрицательных результатов. Секвенирование ДНК у конкретного индивидуума остается единственным методом, позволяющим однозначно ответить на вопрос, какая вариация последовательности гена может привести или не привести к развитию генетического заболевания. И для этого метода чувствительность является главным недостатком.
    Все современные исследовательские компании идут по пути создания коммерчески эффективных методов и тест-систем. Уже сегодня эти исследования в крупных центрах являются рутинной манипуляцией, а технологичность методов делает их широко доступными.
    Становится актуальным внедрение молекулярных подходов в диагностику ПИ в Украине, поскольку по сравнению с европейскими странами и США выявляемость этой патологии вследствие ограниченных возможностей диагностики в нашей стране намного ниже.

Литература
1.    Balogh K., Patocs A., Majnik J., Racz K., Hunyady L. Genetic screening methods for the detection of mutations responsible for multiple endocrine neoplasia type 1 // Mol Genet Metab. – 2004. – Vol. 83. – P. 74-81.
2.    Costabile M., Quach A., Ferrante A. Molecular Approaches in the Diagnosis of Primary Immunodeficiency Diseases // Human Mutation. – 2006. – Vol. 27 (12). – P. 1163-1173.
3.    Cowie S., Drmanac S., Swanson D., Delgrosso K., Huang S., duSart D., Drmanac R., Surrey S., Fortina P. Identification of APC gene mutations in colorectal cancer using universal microarray-based combinatorial sequencing-by-hybridization // Hum Mutat. – 2004. – Vol. 24. – P. 261-271.
4.    Ferrante A., Rowan-Kelly B., Beard L.J., Maxwell G.M. An enzyme-linked immunosorbent assay for the quantification of human IgG subclasses using monoclonal antibodies // J Immunol Methods. – 1986. – Vol. 93. – P. 207-212.
5.    Ganguly A. An update on conformation sensitive gel electrophoresis // Hum Mutat. – 2002. – Vol. 19. – P. 334-342.
6.    Illoh O.C. Current applications of flow cytometry in the diagnosis of primary immunodeficiency diseаses // Arch Pathol Lab Med. – 2004. – Vol. 128. – P. 23-31.
7.    Mockler T.C., Chan S., Sundaresan A., Chen H., Jacobsen S.E., Ecker J.R. Applications of DNA tiling arrays for whole-genome analysis // Genomics. – 2005. – Vol. 85. – P. 1-15.
8.    Morelli A., Falchetti A., Martineti V., Becherini L., Mark M., Friedman E., Brandi M.L. MEN1 gene mutation analysis in Italian patients with multiple endocrine neoplasia type 1 // Eur J Endocrinol. – 2000. – Vol. 142. – P. 131-137.
9.    Murphy K.M., Geiger T., Hafez M.J., Еshleman J.R., Griffin C.A., Berg K.D. A single nucleotide primer extension assay to detect the APC I1307K gene variant // J Mol Diagn. – 2003. – Vol. 5. – P. 222-226.
10.    Nataraj A.J., Olivos-Glander I., Kusukawa N., Highsmith W.E. Single-strand conformation polymorphism and heteroduplex analysis for gel-based mutation detection // Electrophoresis. – 1999. – Vol. 20. – P. 1177-1185.
11.    Oefner P.J., Underhill P.A. Comparative DNA sequencing by denaturing high-perfomance liquid chromatography (dHPLC) // Am J Hum Genet. – 1995. – Vol. 57. – P. 266.
12.    Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., Sekiya T. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms // Proc Natl Acad Sci USA. – 1989. – Vol. 86. – P. 2766-2770.
13.    Ronaghi M., Karamohamed S., Pettersson B., Uhlen M., Nyren P. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release // Anal Biochem. – 1996. – Vol. 242. – P. 84-89.
14.    Roos D., de Boer M., Kuribayashi F., Meischi C., Weening R.S., Segal A.W., Ahlin A. et al. Mutations in the X-linked and autosomal recessive forms of chronic granulomatous disease // Blood. – 1996. – Vol. 87. – P. 1663-1681.
15.    Royer-Pokora B., Kunkel L., Monaco A.P., Goff S.C., New­burger P.E., Baehner R.l., Cole F.S., Curnutte J.T., Orkin S.H. Cloning the gene for an inherited human disorder-chronic granulematous disease on the basis of its chromosomal location // Nature. – 1986. – Vol. 322. – P. 32-38.
16.    Sakharkar M.K., Perumal B.S., Sakharkar K.R., Kangueane P. An analysis on gene architecture in human and mouse genomes // In Silico Biol. – 2005. – Vol. 5. – P. 347-365.
17.    Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R., DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl Acad Sci USA. – 1977. – Vol. 74. – P. 5463-5467.
18.    Stenson P.D., Ball E.V., Mort M., Phillips A.D., Shiel J.A., Thomas N.S., Abeysinghe S., Kraczak M., Cooper D.N. Human Gene Mutation Database (HGMD): 2003 update // Hum Mutat. – 2003. – Vol. 21. – P. 577-581.