Цитологические особенности лимфоцитов у больных с активной герпетической инфекцией: возможности ранней скрининговой диагностики (обзор литературы)

На сегодняшний день герпетическая инфекция является одной из самых распространенных в человеческой популяции. Так, около 95-98% населения планеты инфицированы каким-либо представителем семейства герпесвирусов. В большинстве случаев эта инфекция протекает бессимптомно и не требует диагностики и лечения, однако в последнее время учащаются сообщения об увеличении распространенности ее клинически манифестных форм, что повышает актуальность проблемы своевременного выявления [1, 2]. К сожалению, большинство лечебно-профилактических учреждений Украины не имеет в своем арсенале средств этиотропной диагностики активных форм герпеса (детекции ДНК вируса), а исследования, проводимые частными клиниками, являются дорогостоящими и не могут удовлетворить возрастающие диагностические потребности. Вместе с тем, развитие иммунологии создало предпосылки для разработки быстрого и доступного цитологического скрининга герпетических инфекций, который в силу ряда обстоятельств до сих пор не используется в полной мере в практической медицине. По-видимому, причина сложившейся ситуации заключается как в недостатке иммунологических знаний у медицинского персонала, так и в отсутствии четких и общепризнанных критериев цитологического скрининга. Данная статья призвана восполнить своеобразный «пробел» в проблеме скрининговой диагностики активных инфекций, вызванных герпетическими вирусами, и будет полезной для широкой медицинской аудитории.

Вирусы герпеса являются лимфотропными агентами. Так, вирус Эпштейна – Барр поражает преимущественно В-лимфоциты, а «мишенью» вирусов герпеса 6 и 7 типов являются Т-лимфоциты (CD4+) [1]. Репродукция герпетических вирусов в лимфоцитах приводит, с одной стороны, к развитию лимфоцитоза, а с другой – к изменению их субпопуляционного состава и появлению некоторых новых цитологических признаков. Данный факт может с достаточной степенью достоверности повсеместно использоваться для скрининговой диагностики.
Лимфоцитоз при активной герпетической инфекции имеет сложный генез. С одной стороны, увеличение уровня лимфоцитов связано с усилением лимфопоэза в красном костном мозге, что может быть расценено как проявление иммунореактивности организма [1]. Также усиливается пролиферация лимфоцитов в периферических иммунных органах (селезенке, лимфатических узлах, миндалинах), что является следствием реализации иммунного ответа, направленного против возбудителя [3]. С другой стороны, герпетические вирусы блокируют апоптоз (запрограммированную гибель) инфицированных лимфоцитов, что значительно удлиняет срок жизни этих клеток и является «выгодным» для инфекционного агента, так как способствует более длительному воспроизводству вирусного потомства [9]. Кроме того, некоторые вирусы семейства герпеса способны целенаправленно усиливать пролиферативную активность лимфоцитов. Так, вирус Эпштейна – Барр вызывает поликлональную активацию В-лимфоцитов, что приводит к развитию неспецифического иммунного ответа и является фактором патогенности возбудителя. Поначалу поликлональная активация проявляется в виде лимфоцитоза, однако в последующем регистрируется лимфопения из-за развития феномена «истощения клонов» [3].

Таким образом, длительный лимфоцитоз в формуле крови у пациента со стертыми проявлениями инфекционного синдрома может быть скрининговым лабораторным маркером активной герпетической инфекции и служить показанием к проведению углубленных исследований. Лимфопения на фоне доказанной активной герпетической инфекции указывает на резкое снижение иммунореактивности и резистентности организма, что чревато развитием тяжелых генерализованных инфекций и их осложнений.

Следует помнить, что термин «лимфоцит» является собирательным понятием. Существует множество субпопуляций этих клеток, существенно отличающихся между собой по ряду цитологических признаков [4, 5, 7]. Многие из них содержатся в «нормальной» крови, однако некоторые клетки появляются только в условиях патологии, что может успешно использоваться с диагностической целью. Анализ показателей так называемой лимфограммы предоставляет клиницисту полезную информацию для диагностики как активной герпетической инфекции, так и ряда других патологических состояний организма. Важно отметить, что определение показателей лимфограммы не предполагает использования дорогостоящей аппаратуры или специальных красителей, т. е. такая диагностика не сопровождается существенными дополнительными материальными затратами, в связи с чем может быть широко внедрена в практическую медицину. Единственное необходимое условие – достаточная квалификация врача-лаборанта и клинициста, анализирующего ее результаты.
Лимфоциты различных субпопуляций отличаются друг от друга по ряду цитологических признаков: форме и размерам клеток, ширине цитоплазмы и ее окраске, ядерно-цитоплазматическому соотношению, наличию или отсутствию перинуклеарного просветления и зернистости, размеру и форме ядра, структуре хроматина, наличию или отсутствию нуклеол [7]. В «нормальной» лимфограмме можно различить малые, средние и большие лимфоциты [4, 7]. Основное количество последних составляют так называемые большие гранулярные лимфоциты (БГЛ), поскольку в их цитоплазме находятся гранулы, содержащие перфорины и гранзимы [8].
Малые лимфоциты (клетки Говалло) по размеру не больше обычного эритроцита [3]. Практически всю клетку выполняет ядро, цитоплазма же едва различима в виде узкого ободка по периферии. Иногда ядро расположено несколько эксцентрично, что приводит к появлению серповидного участка цитоплазмы на одном из полюсов клетки. Считается, что малые лимфоциты являются молодыми формами, вышедшими непосредственно из костного мозга и обладающими до определенной степени полипотентными свойствами. В частности, эти лимфоциты участвуют в уничтожении инфицированных вирусом и опухолевых клеток, а также в реакциях клеточного иммунитета. При вирусной инфекции или опухолевой патологии их содержание может существенно возрастать. В норме не менее 5% лимфоцитов циркулирующей крови относятся к субпопуляции малых клеток (среднее содержание – 5-10%).

Несмотря на активные дискуссии вокруг клеток Говалло, мы считаем определение их уровня весьма полезным и информативным при оценке состояния противовирусного и противоопухолевого иммунитета с прогностической целью как на преморбидном фоне, так и в условиях уже развившейся патологии.

Средние лимфоциты имеют диаметр около 10-12 мкм и составляют основной пул лимфоидных элементов крови. К ним относятся Т- и В-лимфоциты, принимающие участие в осуществлении реакций приобретенного иммунитета, направленного против разнообразных патогенов. Средние лимфоциты имеют круглое или овальное ядро, нередко содержащее небольшое вдавление. Характер хроматина – грубо-глыбчастый, напоминающий картину «гор и долин». В целом ядро окрашено интенсивно, можно наблюдать остатки ядрышек. Серовато-голубая или светло-базофильная цитоплазма нешироким, но хорошо различимым ободком окружает ядро. Перинуклеарного просветления обычно нет. Зернистость цитоплазмы также обычно не наблюдается или же видны отдельные пылевидные азурофильные зернышки. Цитологически Т- и В-лимфоциты не отличаются друг от друга [7].
БГЛ имеют вид крупных клеток (диаметр 12-15 мкм) с широким ободком голубоватой или почти бесцветной цитоплазмы (рис. 1). Форма клеток – округлая или овальная. В цитоплазме содержится несколько гранул, окрашивающихся азуром в темно-красный или вишнево-фиолетовый цвет. Круглое или овальное ядро обычно располагается эксцентрично, хроматин гомогенен. Основное количество БГЛ представлено так называемыми естественными киллерами, принимающими участие в уничтожении инфицированных вирусом, опухолевых, мутантных и чужеродных клеток при помощи реакции спонтанной цитотоксичности [8].
У здоровых людей уровень БГЛ в крови должен составлять не менее 5% от общего количества лимфоцитов. Если говорить об абсолютном содержании БГЛ, мы рекомендуем считать нормальными уровни в диапазоне от 0,25 до 0,4х10⁹/л.

Повышение содержания БГЛ в крови является адекватной реакцией иммунитета в ответ на действие вирусов. Стойкое (более 2 нед) и выраженное (более чем на 50% от нижней границы нормы) снижение уровня БГЛ предполагает склонность к частым и затяжным вирусным инфекциям в связи с поражением клеточного звена врожденного противовирусного иммунитета. У таких больных чаще всего регистрируются хронические активные герпетические инфекции с высоким риском развития органных поражений. При продолжительном дефиците БГЛ и наличии симптомов инфекционного процесса необходима консультация клинического иммунолога и назначение иммунотропных препаратов [3].

Плазматические клетки (плазмоциты) также относятся к субпопуляции больших лимфоцитов. Плазмоциты – это антителосинтезирующие клетки, которые являются производными В-лимфоцитов. В норме почти все плазматические клетки содержатся в периферических иммунных органах, однако при раздражении лимфоцитарного звена иммунитета они поступают в циркулирующую кровь, где могут быть выявлены цитологически в единичных экземплярах. При активных герпетических инфекциях содержание плазматических клеток в периферической крови может существенно возрастать, достигая 1-3% от общего пула лимфоцитов.

Резкое увеличение содержания плазматических клеток свидетельствует о выраженном гуморальном иммунном ответе против вирусов семейства герпеса, являясь показателем иммунореактивности организма и диагностическим маркером активной инфекции.

По цитологическим признакам выделяют две формы плазматических клеток:
• плазмоциты первого типа имеют пикнотическое ядро с четкой колесовидной структурой, расположенное, как правило, эксцентрически, а также интенсивно окрашенную базофильную цитоплазму с перинуклеарной зоной просветления и вакуолями;
• плазмоциты второго типа характеризуются теми же признаками, но имеют больший размер и серовато-голубую цитоплазму с менее отчетливой перинуклеарной зоной просветления [7].
Таким образом, выше изложены цитологические особенности субпопуляций «нормальной» лимфограммы. В условиях активной герпетической инфекции в крови в небольшом количестве появляются некоторые патологические формы лимфоцитов, не наблюдаемые в крови здоровых людей. В частности, речь идет об атипичных мононуклеарах, иммуноцитах, лимфоцитах-центроцитах и лимфоплазмоцитах, что может быть информативным скрининговым диагностическим маркером активной инфекции.
Атипичные мононуклеары (лимфомоноциты) впервые описаны при инфекционном мононуклеозе, однако могут выявляться и при других герпетических инфекциях (рис. 2). И.А. Кассирский назвал эти клетки вироцитами, подчеркивая тесную связь между их появлением в периферической крови и наличием вирусной инфекции. Это крупные клетки диаметром около 15-20 мкм овальной или неправильной формы. Цитоплазма широкая и занимает больше половины объема клетки, имеет фиолетовый оттенок, сгущающийся к периферии, из-за чего в центре наблюдается выраженное перинуклеарное просветление, а вдоль края формируется темный кант (феномен плазматизации). Иногда цитоплазма и ядро атипичных мононуклеаров имеют широкие выросты, благодаря которым эти клетки очень напоминают моноцит. Плазматизация, напротив, сближает атипичные мононуклеары с плазмоцитами. Ядро атипичного мононуклеара располагается, как правило, эксцентрично. Хроматин в основном гомогенен, содержит отдельные трещины (без картины «гор и долин»). Реже хроматин расположен рыхло, что обусловливает определенное сходство с пролимфоцитом.

Содержание атипичных мононуклеаров при герпетической инфекции широко варьирует: от 1-2% при активной хронической инфекции, вызванной герпесом 6 типа, до 10% и более при остром инфекционном мононуклеозе Эпштейна – Барр вирусной этиологии [4, 7].

Иммуноцит – клетка размером 12-15 мкм округлой или овальной формы (рис. 3). Цитоплазма обычно серо-голубая, часто – с темным кантом по периферии, нередко наблюдается вакуолизация и азурофильная зернистость. Ядро занимает половину или большую часть клетки, располагается центрально или несколько эксцентрично. Хроматин гомогенен, с характерными трещинами, напоминающими дно высохшей лужи.

Иммуноциты составляют основную массу лимфоцитов при лимфоцитоме, а в условиях герпетической инфекции встречаются в единичных экземплярах. Это необходимо учитывать при дифференциальной диагностике [7].

Лимфоцит-центроцит – маленькая клетка (диаметр – 7-8 мкм) с очень узким ободком цитоплазмы, не полностью охватывающей ядро (рис. 4). Цитоплазма синяя, без зернистости. Ядро гомогенное, плотное, практически лишенное структуры, напоминает по плотности «вишневую косточку» оксифильного эритрокариоцита.

Лимфоциты-центроциты составляют основную массу лимфоцитов при центрофолликулярной лимфоме. При активной герпетической инфекции встречаются в препарате в единичных экземплярах [4].

Лимфоплазмоциты – своеобразные клетки, по цитологическим признакам напоминающие одновременно и лимфоцит, и плазмоцит (рис. 5). Средний диаметр – около 12 мкм. Цитоплазма синевато-фиолетовая без отчетливого перинуклеарного просветления и зернистости. Ядро имеет черты зрелой клетки с грубой структурой хроматина (картина «гор и долин»).

В больших количествах лимфоплазмоциты образуются при секретирующих формах хронического лимфолейкоза, а при активной герпетической инфекции могут быть выявлены единичные экземпляры во время детального исследования препарата крови [4, 7].

Обобщая изложенные данные, следует отметить, что размер, степень базофилии цитоплазмы и характер распределения хроматина ядер не являются критериями возраста каждой конкретной клетки, однако могут служить признаками ее активации. Увеличение размера клетки, понижение ее ядерно-цитоплазматического соотношения, смещение ядра к периферии, гомогенизация и просветление структуры хроматина, повышение базофильности цитоплазмы являются четкими критериями активационных процессов, происходящих в лимфоците. Если такие изменения регистрируются во многих клетках, можно с большой долей вероятности говорить об активации инфекционного процесса.
В соответствии с изложенными выше представлениями, группой российских ученых предложено деление лимфоцитов на четыре типа, характеризующихся разной степенью активации [5]:
• неактивные лимфоциты:
• лимфоциты I типа имеют очень плотное ядро и почти невидимую цитоплазму (N=35,6±3,7%);
• лимфоциты II типа также содержат плотное ядро, однако хорошо различимую серповидную цитоплазму (N=37,2±1,75%);
• промежуточная фракция (в состоянии перехода к активной деятельности) – лимфоциты III типа (N=27,6±3,5%);
• активные лимфоциты – лимфоциты IV типа содержат рыхлое ядро и широкую цитоплазму (N=4,0±0,3%).

Согласно нашим наблюдениям, при активной герпетической инфекции происходит увеличение уровня циркулирующих активированных лимфоцитов IV типа на фоне снижения содержания фракций неактивных клеток, что можно с успехом использовать при скрининговой диагностике.
Наш опыт показывает, что у больных с активной герпетической инфекцией могут также появляться дополнительные микроядра в лимфоцитах, описанные при радиационном поражении крови, что указывает на повреждение генетического аппарата клеток [6]. Это закономерно, поскольку некоторые герпетические вирусы (в частности Эпштейна – Барр вирус и вирус герпеса 8 типа) обладают канцерогенной активностью [3].

Выводы
1. Стойкий лимфоцитоз у пациента со стертой клиникой инфекционного синдрома является одним из наиболее информативных и доступных скрининговых диагностических признаков активной герпетической инфекции и показанием к более углубленному исследованию – изучению показателей лимфограммы (субпопуляционного состава лимфоцитов крови) и этиотропной диагностике (полимеразная цепная реакция, вирусологический метод).
2. Анализ показателей лимфограммы в условиях активной герпетической инфекции позволяет оценить состояние иммунореактивности организма, предоставляя полезную диагностическую и прогностическую информацию в каждом конкретном случае, а некоторым больным – назначить иммуномодулирующую терапию.
3. В лимфограмме человека следует различать нормальные (малые, средние и большие лимфоциты) и патологические (атипичные мононуклеары, иммуноциты, лимфоциты-центроциты, лимфоплазмоциты) субпопуляции лимфоцитов. При этом необходимо помнить, что при активной герпетической инфекции наблюдается изменение соотношения субпопуляций нормальных лимфоцитов и появление ряда патологических клеток, не встречающихся у здоровых.
4. Проведение лимфограммы не требует существенных дополнительных материальных затрат, что позволяет широко внедрить ее в клиническую практику.
5. В связи с отсутствием четких и общепризнанных критериев интерпретации результатов лимфограммы необходимы дополнительные научные исследования в этом перспективном направлении.

Литература
1. Абатуров А.Б., Шостакович-Корецкая Л.Р. HHV-6 инфекция у детей // Здоровье ребенка. – 2007. – № 3. – С. 70-80.
2. Башлыкова М.В., Масюкова С.А., Каримова И.М. Совершенствование современных методов диагностики и лечения герпетической и цитомегаловирусной инфекций // Вестник дерматологии и венерологии: Науч.-практ. рецензируемый журн. – 2001. – № 5. – С. 12-14.
3. Казмірчук В.Є., Ковальчук Л.В. Клінічна імунологія та алергологія. – Вінниця: Нова книга, 2006. – 526 с.
4. Кременецкая А.М., Воробьев И.А., Сидорова Ю.В. и др. Морфология лимфоцитов // Терапевт. архив. – 1998. – № 7. – С. 37-39.
5. Новодержкина Ю.К., Шишканова З.Г., Погорелов В.М. и др. Морфологическая характеристика лимфоцитов через 6 лет после аварии в Чернобыле // Гематология и трансфузиология. – 1995. – Т.40, № 3. – С. 39-42.
6. Романова О.П. Частота мікроядер у лімфоцитах периферичної крові жителів міста Києва. – К.: Трансфер, 1999. – 10 с.
7. Руководство по клинической лабораторной диагностике: В 2-х т. / Под ред. М.А. Базаровой. – К: Вища школа, 1991.
8. Сепиашвили Р.И., Балмасова И.П. Физиология естественных киллеров. – М.: Медицина-Здоровье, 2005. – 455 с.
9. Salmon M., Pilling D., Borthwick N.J., Akbar A.N. Inhibition of T-cell apoptosis – a mechanism for persistence in chronic inflammation // The immunologist. – 1997. – Vol. 5, N 3. – P. 87-92.