Вплив різних доз низькомолекулярного індуктора ендогенного інтерферону на клітинну та гуморальну ланки системи імунітету у мишей лінії C57BL/6

Використання інтерферону (ІФН) або його індукторів у схемах протипухлинної біотерапії на сьогодні набуває все більшого поширення. Це обумовлене тим, що система імунітету відіграє провідну роль у забезпеченні загальної резистентності організму та виступає одним з основних етіопатогенетичних чинників при розвитку низки захворювань, зокрема онкопатології. Для вдосконалення технологій біотерапії пухлинної хвороби особливо важливим є розуміння функцій та механізмів дії цитокінів, які посилюють здатність ефекторів протипухлинного захисту елімінувати злоякісні клітини. Біологічні модифікатори імунної відповіді досить часто використовуються в технологіях створення протипухлинних вакцин як їх складові компоненти або ад’юванти. У найпростішому варіанті цитокіни вводять разом з пухлинним антигеном та стимулюють локальну імунну відповідь на нього [32]. З огляду на це, одним з важливих принципів сучасної біотерапії вважається її комплексність із застосуванням у разі необхідності диференційованої імунокорекції за допомогою цитокінів.

Значну увагу приділяють індукторам ендогенного ІФН (ІЕІ), застосування яких є універсальним способом підвищення неспецифічної резистентності організму при розвитку різних патологічних станів. Слід зазначити, що механізм дії і спектр активності ІФН та їх індукторів практично ідентичні. Водночас застосування ІЕІ має цілу низку переваг. Зокрема, вони:

• є гіпоалергенними і не призводять до формування в організмі аутологічних антитіл;
• здатні зумовлювати пролонговану продукцію ІФН у фізіологічних дозах, достатніх для досягнення певної терапевтичної мети;
• добре розчиняються в біологічних рідинах, мають високу біодоступність, а при поєднанні з іншими препаратами – забезпечують ефект синергізму;
• не спричинюють гіперінтерферонемію і пов’язані з нею побічні ефекти [9, 17].

До перших інтерфероногенних препаратів слід віднести тилорон (дигідрохлорид 2,7-біс-[2-(діетил­аміно)етокси]-флуорен-9-он), який був синтезований і вивчений групою американських дослідників у 1968 р. Починаючи з 70-х років розпочались інтенсивні дослідження його механізмів дії.

Тилорон відносять до індукторів «пізнього» ІФН у зв’язку з тим, що після одноразового введення препарату високий рівень ІФН в сироватці крові (СК) визначається протягом 48-72 год [4].

Основними продуцентами ІФН у відповідь на введення тилорону є Т-лімфоцити. При цьому синтез може відбуватися в чистій культурі без участі допоміжних клітин. Тилорон відновлює співвідношення Т-хелпери/Т-супресори, підвищує активність природних кілерних клітин (ПКК) і цитотоксичність лімфоцитів, активує фагоцитоз [7, 38]. Він виявився ефективним при лікуванні вірусних інфекцій та онкологічних захворювань [6, 9, 14, 31, 33, 37].

Водночас серед дослідників не існує одностайного погляду щодо механізмів його дії. Існування протилежних результатів експериментальних досліджень, одержаних різними авторами в різних країнах, частково можна пояснити відмінностями схем та доз застосування тилорону [5, 21, 24, 25, 29, 39].

У Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України наприкінці 1980-х років була розроблена технологія та організовано виробництво дигідрохлориду 2,7-біс-[2-(діетиламіно)етокси]-флуорен-9-ону (аміксину). На підставі цієї субстанції згодом була створена технологія виробництва лікарського препарату – індуктора ІФН аміксину у вигляді пігулок по 0,125 г. Препарат виробляється ТДВ «ІнтерХім» (Одеса, Україна). Результати багаточисленних експериментальних та клінічних досліджень свідчать про достатньо широкий спектр фармакологічної активності аміксину за рахунок множинності ефектів ІФН, індукованого препаратом [11, 19, 20, 23, 26, 40].

Важливо підкреслити, що імуномодулювальна дія аміксину спрямована на корекцію порушень як природного (неспецифічного), так і адаптивного імунітету, оскільки він є поліклональним стимулятором, який запускає швидкодіючу ланку природного імунітету – систему ІФН (синтез ІФН-α, -β та -γ в гепатоцитах, Т-лімфоцитах, гранулоцитах, нейтрофілах та інших клітинах) [27]. На сьогодні накопичений вагомий матеріал щодо ефективності аміксину як протипухлинного агента. Зокрема, гальмування росту новоутворень, зниження частоти і ступеню метастазування були продемонстровані при застосуванні аміксину в комбінації з протипухлинними препаратами [10, 12, 13].

Беручи до уваги широкий спектр біологічної активності аміксину, а також аналіз наукової літератури щодо перспективності його використання в схемах протипухлинної терапії, видається логічним детальніше вивчення його ефективності при включенні до схем вакцинотерапії раку [33].

Водночас, залишається невирішеним питання щодо особливостей імуномодулювальної дії аміксину в умовах норми з урахуванням залежності доза–ефект. Відповідь на це питання дасть змогу нам не лише знайти оптимальні дози, що індукують ефективну імунну відповідь, але й обгрунтувати доцільність їх використання в схемах протипухлинної вакцинотерапії.

Враховуючи викладене вище, метою даної роботи стало вивчення дозозалежного впливу аміксину на показники клітинної та гуморальної ланок системи імунітету інтактних мишей лінії C57BL/6.

Матеріали та методи дослідження

вверх

Робота виконана на статевозрілих мишах-самках лінії C57BL/6 з вихідною масою 19-20 г розводки віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ. Утримання тварин та робота з ними проводились у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил з біологічної етики та виконання робіт з експериментальними тваринами [8]. У роботі використовували здорових лабораторних тварин, які до початку експерименту протягом 14 діб знаходились в умовах карантину. Надалі тварин утримували в приміщенні з постійною температурою на збалансованому харчовому раціоні.

Як ІЕІ використовували субстанцію аміксин, розроблену у Фізико-хімічному інституті ім. О.В. Богатського НАН України (м. Одеса, Україна).

Аміксин розводили ex tempore і вводили тваринам per os тричі (два перші введення з інтервалом 24 год, третє – через 96 год) у таких разових дозах: 500 мг/кг, 30 мг/кг, 3 мг/кг.

Мишей було розподілено на 4 групи: група ІК – інтактний контроль, миші отримували замість препарату фізіологічний розчин; група Аміксин-500 – тварини, які отримували препарат у дозі 500 мг/кг (10 мг/мишу); група Аміксин-30 – тварини, які отримували препарат у дозі 30 мг/кг (0,6 мг/мишу); група Аміксин-3 – тварини, які отримували препарат у дозі 3 мг/кг (0,06 мг/мишу).

Імунологічні дослідження проводили на 3-тю (тваринам двічі вводили препарат), 7-му, 16-ту та 22-гу добу (тварини отримали весь курс препарату) після першого введення аміксину. Імунотоксичні прояви застосування аміксину оцінювали за зміною загальної маси тварин, питомої маси і клітинності імунокомпетентних органів: тимусу, селезінки, лімфатичних вузлів. Зміни показників периферійної крові аналізували на автоматичному гемоаналізаторі РСЕ-210. Визначали абсолютний вміст лейкоцитів, тромбоцитів, еритроцитів, абсолютний і відносний вміст лімфоцитів, моноцитів, гранулоцитів, рівень гемоглобіну [22]. Вплив різних доз препарату на ефекторні реакції неспецифічного імунітету оцінювали за допомогою реакцій лімфоцитів периферійних лімфатичних вузлів на введення поліклональних Т-клітинного (конканавалін А, Sigma, США) та В-клітинного (ЛПС Salmonella typhimurium, Sigma, США) мітогенів в МТТ-тесті [1, 28]. Цитотоксичну активність ПКК, перитонеальних макрофагів (МФ), СК, а також впливу останньої на цитотоксичну активність ПКК і МФ оцінювали в МТТ-тесті [2, 35]. Рівень продукції МФ in vitro фактора некрозу пухлин (ФНП) визначали за допомогою біологічного методу з використанням ФНП-чутливої культури клітин L-929 [30]. Наявність ІЛ-1 в супернатантах спленоцитів мишей оцінювали в біологічному тесті костимуляції тимоцитів в присутності конканаваліну А (Кон А). [1]. Рівні ІФН-γ та ІЛ-10 визначали в СК та/або в супернатантах спленоцитів мишей за допомогою комерційної тест-системи BD OptEIA Mouse IFN-γ Set (BD Biosciences, США) згідно з інструкцією. Вимірювання оптичної густини проводили при λ=450 нм проти λ=570 нм на автоматичному рідері StatFax 2100 (США).

Рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у СК мишей визначали методом селективної преципітації в поліетиленгліколі (ПЕГ): високомолекулярних ЦІК – з використанням 3% ПЕГ, середньомолекулярних ЦІК – 4,5% ПЕГ, низькомолекулярних ЦІК – 6% ПЕГ [15].

Для порівняння показників тварин дослідних і контрольних груп розраховували індекси модуляції [16]. Статистичну обробку результатів досліджень проводили з використанням t-критерію Стьюдента [18].

Результати дослідження та їх обговорення

вверх

У результаті проведених досліджень було показано, що аміксин має певну дозозалежну імунотоксичну дію. Так, у дозі 500 мг/кг препарат вдалося ввести експериментальним тваринам лише двічі з подальшою відміною третього введення, оскільки в зазначений термін спостереження фіксували загибель 20% тварин у групі. Зміни показника маси інтактних мишей та тварин, яким вводили аміксин у різних дозах, представлені на рисунку.

На 3-тю добу після другого введення препарату у групі Аміксин-500 відмічали достовірне зниження маси мишей (в 1,2 раза, p<0,05 порівняно з групою ІК). Відновлення цього показника до рівня ІК спостерігали лише на 22-гу добу експерименту. Миші, яким вводили препарат у нижчих дозах – 30 мг/кг або 3 мг/кг, отримали повний курс препарату, причому загибелі тварин у цих групах зафіксовано не було. Втрату маси мишей зазначених груп відмічали лише на 3-тю добу, надалі досліджуваний показник був на рівні ІК.

Додатковим критерієм для відміни 3-го введення аміксину в дозі 500 мг/кг слугували також результати його впливу на показники периферійної крові (табл. 1). Як видно з таблиці, на 3-тю добу після другого введення препарату в периферійній крові мишей групи Аміксин-500 спостерігали достовірне зниження, порівняно з ІК, загальної кількості лейкоцитів – у 2,0 раза (p<0,05); абсолютної та відносної кількості лімфоцитів – у 3,2 та 1,3 раза відповідно (p<0,05), з одночасним підвищенням відносного вмісту моноцитів у 1,7 раза (0,05<p<0,1). Зазначені зміни показників, хоча і меншою мірою, фіксували і на 7-му добу експерименту.

Таблиця 1. Вплив різних доз препарату аміксин на показники периферійної крові інтактних мишей лінії C57BL/6

Показник	ІК, n=5	Аміксин-500 мг/кг		Аміксин-30 мг/кг			Аміксин-3 мг/кг
		Доба після першого введення препарату
		3-тя	7-ма	3-тя	7-ма	16-та	3-тя	7-ма	16-та
Лейкоцити, х109/л	7,9±0,7	3,4±0,9*	4,3±1,2*	5,3±1,5	7,7±1,8	6,4±1,5	6,9±1,3	7,6±0,3	9,5±1,6
Еритроцити, х1012/л	13,8±1,9	14,3±2,3	9,8±2,1	19,5±0,6*	19,4±0,4*	8,6±0,1*	13,8±4,0	17,7±2,3	7,9±2,1**
Тромбоцити, х109/л	570,0±137,8	422,2±98,3	231,0±63,3**	433,7±143,9	585,0±62,5	337,7±11,2	373,3±95,3	578,7±185,4	484,0±308,3
Гемоглобін, г/л	138,7±3,4	158,0±5,8*	87,7±44,4	146,7±0,2**	158,0±0,7*	153,0±5,6**	152,0±12,9	141,7±3,2	134,5±38,9
Лейкоцитарна формула
Лімфоцити, х106/л	5,4±0,6	1,7±0,5*	2,4±0,8*	3,3±0,8**	5,5±1,4	4,6±1,0	4,5±0,9	5,0±0,4	6,3±0,2
Моноцити, х106/л	1,1±0,1	0,8±0,3	0,8±0,2	0,9±0,3	1,0±0,2	0,7±0,2	1,1±0,1	1,1±0,1	1,4±0,6
Гранулоцити, х106/л	1,4±0,2	0,8±0,2	1,1±0,2	1,1±0,4	1,2±0,1	1,1±0,2	1,3±0,4	1,5±0,2	1,8±0,8
Лімфоцити, %	68,0±2,8	51,5±6,9**	54,9±4,7**	63,5±2,5	71,2±1,7	70,9±0,2	65,4±3,7	65,7±4,3	67,5±8,8
Моноцити, %	13,7±0,8	23,3±3,5*	19,1±1,1*	15,9±2,0	12,5±0,8	11,1±1,0**	15,9±1,4	14,9±1,6	14,4±3,6
Гранулоцити, %	18,3±2,2	25,1±4,8	26,1±3,9	20,6±2,4	16,3±1,9	18,0±1,1	18,7±3,8	19,4±3,0	18,1±5,2

Примітка: * р<0,05 порівняно з ІК; ** 0,05<р<0,1 порівняно з ІК.

У мишей цієї групи відмічали негативний вплив аміксину на вагові та клітинні параметри периферійних імунокомпетентних органів (тимус, селезінка, перифе­рій­ні лімфатичні вузли). Як видно з табл. 2, на 3-тю добу після початку введення препарату достовірно зниженими (р<0,05), порівняно з ІК, були маса селезінки (ІМ=–30,1%); відносна маса (ІМ=–63,9%) і клітинність тимусу (–66,0%) та периферичних лімфатичних вузлів (ІМ=–40,9%); кількість перитонеальних МФ (ІМ=–40,9%). На 7-му добу суттєво зниженими залишались вагові та клітинні показники тимусу (р<0,05). Враховуючи те, що тимус є центральним органом системи імунітету, а також основним джерелом і постачальником лімфоцитів на периферію, його інволюція відображає ефекти токсичного впливу аміксину, про що свідчить і пригнічення функціональної активності лімфоцитів периферійних лімфовузлів (ІМ=–55,7%, р<0,05 порівняно з ІК).

Таблиця 2. Показники маси і клітинності імунокомпетентних органів мишей лінії C57BL/6 після введення різних доз аміксину

Показник	ІК, n=5	Аміксин-500 мг/кг		Аміксин-30 мг/кг			Аміксин-3 мг/кг
		Доба після першого введення препарату
		3-тя	7-ма	3-тя	7-ма	16-та	3-тя	7-ма	16-та
Маса тварини, г	19,6±0,6	17,3±1,4	18,2±0,1	19,2±0,1	21,4±0,5**	18,4±1,1	19,4±0,2	20,7±0,5	18,4±0,9
Відносна вага, 10-3
Селезінка	5,8±0,6	4,6±0,5	6,7±1,7	6,0±0,2	4,2±0,3**	6,9±1,3	5,8±0,7	3,7±0,6**	6,1±1,4
Тимус	3,6±0,4	1,3±0,3*	1,0±0,2*	1,7±0,0*	1,5±0,2*	1,5±0,2*	1,4±0,0*	1,1±0,1*	1,2±0,1*
Периферійні лімфовузли	2,0±0,2	2,3±0,3	1,7±0,2	1,8±0,1	1,5±0,2	2,3±0,3	1,6±0,5	1,4±0,2	1,5±0,2
Клітинність на 1 мг органа
Селезінка	0,8±0,1	1,3±0,1*	0,6±0,2	0,9±0,0	0,9±0,1	0,9±0,3	1,0±0,0*	1,2±0,1*	1,3±0,3
Тимус	2,1±0,5	0,7±0,1*	0,7±0,3*	2,0±0,2	1,9±0,1	1,9±0,3	2,3±0,3	1,6±0,1	2,4±0,5
Периферійні лімфовузли	1,1±0,1	0,6±0,1*	1,2±0,2	1,3±0,1*	0,9±0,1	1,2±0,1**	1,4±0,1*	1,1±0,1	0,9±0,1
Клітинність, х106
МФ	2,2±0,2	1,1±0,1*	1,9±0,6	2,1±0,2	2,7±0,4	2,2±0,4	4,2±0,9**	2,1±0,4	3,9±0,5*

Примітка: * р<0,05 порівняно з ІК; ** 0,05<р<0,1 порівняно з ІК.

Слід зазначити, що на 3-тю та 7-му добу після першого введення аміксину в дозі 500 мг/кг спостерігали зниження цитотоксичної активності СК дослідних тварин порівняно з ІК (див. табл. 2). Цікавим виявився той факт, що СК цих тварин, не маючи власної цитотоксичності, суттєво впливала на цитотоксичну активність ПКК та МФ (ІМ=+22% та +69,6% відповідно), що, вірогідно, може свідчити про розвиток певної запальної реакції в організмі тварин.

Таким чином, враховуючи отримані результати щодо токсичного впливу аміксину в дозі 500 мг/кг на імунну систему дослідних тварин, подальші наші дослідження були спрямовані на вивчення біологічних ефектів цього препарату, введеного в нижчих дозах, а саме 30 мг/кг та 3 мг/кг.

Визначення загального рівня ЦІК є важливим показником для оцінки негативного впливу досліджуваного препарату на організм експериментальних тварин. Відомо, що саме молекулярна маса ЦІК характеризує їх токсичність: високомолекулярні ЦІК відносно малотоксичні, оскільки досить швидко елімінуються з кров’яного русла; тоді як ЦІК малого та середнього розміру мають значну комплемент-зв’язувальну здатність та, взаємодіючи з калікреїн-кініновою системою згортання крові та іншими регуляторними системами організму, спричинюють розвиток реакції запалення і пошкодження тканин організму, і тому вважаються найбільш токсичними [3, 34].

Як видно з табл. 3, застосування аміксину в дозах 30 мг/кг та 3 мг/кг не справляло суттєвого впливу на більшість досліджуваних показників, крім суттєвого зниження на 3-тю добу після першого введення рівнів низько-, середньо- і високомолекулярних ЦІК у мишей групи Аміксин-30, при цьому рівень низькомолекулярних ЦІК залишався зниженим до 7-ї доби. На 16-ту добу відмічали зниження рівня низькомолекулярних ЦІК у мишей групи Аміксин-3. Отримані дані, з одного боку, можуть свідчити про відсутність вмісту токсигенних ЦІК у кров’яному руслі дослідних тварин і тим самим – про нетоксичність обраних доз препарату; а з другого – про недостатність функціональної активності В-лімфоцитів, що певним чином підтверджується даними про відсутність відповіді лімфоцитів на ЛПС (табл. 4).

Таблиця 3. Показники рівня ЦІК різної молекулярної маси в СК мишей лінії C57BL/6 та тварин, яким вводили аміксин у різних дозах

Група тварин	Рівень ЦІК, у. о.
	Високо-молекулярні	Середньо-молекулярні	Низько-молекулярні
ІК	7,5±0,4	19,5±1,1	30,5±3,2
3-тя доба після першого введення аміксину
Аміксин-30 мг/кг	1,0±0,7*	10,0±1,4*	9,5±2,5*
Аміксин-3 мг/кг	7,7±2,7	20,7±1,9	21,7±7,0
7-ма доба після першого введення аміксину
Аміксин-30 мг/кг	10,7±1,7	14,7±8,8**	41,3±0,9*
Аміксин-3 мг/кг	8,7±4,7	14,0±4,7	26,7±12,2
16-та доба після першого введення аміксину
Аміксин-30 мг/кг	6,0±0,0*	11,0±3,5**	17,5±9,5
Аміксин-3 мг/кг	6,0±3,5	19,0±11,3	7,0±2,8*
22-га доба після першого введення аміксину
Аміксин-30 мг/кг	11,0±1,4**	18,5±2,5	24,0±9,2
Аміксин-3 мг/кг	7,5±2,5	26,5±0,4**	24,5±6,0

Примітка: * р<0,05 порівняно з ІК; ** 0,05<р<0,1 порівняно з ІК.

Таблиця 4. Зміни клітинних реакцій неспецифічного імунітету у мишей лінії C57BL/6 після введення різних доз аміксину

Показник	ІК	Аміксин-500 мг/кг		Аміксин-30 мг/кг			Аміксин-3 мг/кг
		Доба після першого введення препарату
		3-тя	7-ма	3-тя	7-ма	16-та	3-тя	7-ма	16-та
Цитотоксична активність ефекторів неспецифічного імунітету (ІЦ,%)
МФ	41,6±6,7	27,3±2,2**	51,1±1,0	46,6±0,7	53,3±2,7	37,3±1,5	46,8±1,9	55,2±1,9	38,1±2,1
ПКК, ІЦ	41,2±2,0	44,4±1,8	53,7±1,7*	44,2±6,7	45,6±2,5	29,4±4,7**	51,2±1,2*	47,3±1,3*	27,6±1,6*
СК, ІЦ	19,5±4,6	1,8±1,1*	8,2±2,8**	4,0±2,0*	7,1±3,3**	46,0±7,4*	9,7±4,2	18,1±4,0	69,0±0,3*
АЗКЦ МФ	31,2±8,8	25,3±3,3	52,9±3,2**	52,3±1,2**	56,4±3,9*	39,5±1,5	50,8±0,5**	54,7±2,8*	35,9±2,5
АЗКЦ ПКК	41,4±2,1	45,0±1,7	50,5±1,7*	48,4±1,3*	45,2±0,8	31,6±3,4**	51,4±1,6*	48,8±2,0*	30,3±1,4*
Функціональна активність лімфоцитів периферійних лімфатичних вузлів у реакції бласттрансформації на:
Кон А, ІС,%	116,8±8,6	111,2±13,3	51,7±17,6*	230,0±51,7**	203,4±11,9*	–	160,2±29,9	185,2±21,3*	–
ЛПС, ІС,%	10,9±6,1	15,9±4,8	4,1±4,1	4,5±2,6	13,4±9,7	–	6,2±3,9	9,7±3,4	–

Примітка: * р<0,05 порівняно з ІК; ** 0,05<р<0,1 порівняно з ІК.

Триразове введення аміксину в дозі 30 мг/кг та 3 мг/кг не призводило ні до втрати ваги, ні до загибелі тварин, але, водночас, мало дозозалежний вплив на показники крові, вагові і клітинні параметри імунокомпетентних органів та відповідні імунні реакції (див. табл. 1-3).

Як видно з табл. 1, курсове введення аміксину в дозі 30 мг/кг не призводило до суттєвих змін показників периферійної крові дослідних мишей, крім достовірного підвищення кількості еритроцитів на 3-тю і 7-му добу (ІМ=+41,0% і +40,0% відповідно, p<0,05 у порівнянні з ІК) з подальшим зниженням їх абсолютної кількості та підвищення у 1,2 раза рівня гемоглобіну. У тварин групи Аміксин-3 не відбувалося змін досліджуваних параметрів у жодний з термінів спостереження.

У мишей обох досліджуваних груп реєстрували зниження відносної маси тимусу протягом всього терміну спостереження з одночасним підвищенням (хоча і на рівні тенденції) відносної клітинності селезінки та лімфатичних вузлів (див. табл. 2). Разом з тим, у групі Аміксин-3 достовірно збільшувалась загальна кількість перитонеальних МФ. Тобто, аміксин у дозах 30 мг/кг або 3 мг/кг не проявляв імунотоксичного впливу, а скоріше сприяв міграції зрілих лімфоцитів з тимусу до периферійних органів, що свідчить про певну активацію системи імунітету дослідних тварин.

Підтвердженням цього може слугувати підвищення індукованої Кон А проліферативної активності лімфоцитів периферійних лімфатичних вузлів на 3-тю (ІМ₃₀=+96,9%, 0,05<р<0,1) та 7-му добу спостереження (ІМ₃₀=+74,1%, ІМ₃=+58,6%, р<0,05) в порівнянні з ІК. Водночас слід відмітити, що в жодний з термінів спостереження, незалежно від дози, аміксин не впливав на проліферативну активність лімфоцитів у відповідь на ЛПС (див. табл. 4).

Результати дослідження впливу аміксину на клітинні (цитотоксична активність ПКК і МФ) та гуморальні (цитотоксична активність СК) фактори неспецифічної ланки імунної системи наведені в табл. 4. В обох дослідних групах на 3-тю та 7-му добу після початку експерименту відмічали стимулювальний вплив аміксину на активність ПКК та МФ як за наявності аутологічної СК, так і без неї. Цитотоксична активність самої СК була суттєво зниженою. В подальшому (на 16-ту добу) у дослідних мишей відмічали зниження цитотоксичної активності ПКК (у групі Аміксин-30 – на рівні тенденції (ІМ=–23,7%), у групі Аміксин-3 – суттєво (ІМ=–27%, р<0,05) з одночасним достовірним збільшенням цитотоксичної активності аутологічної СК (ІМ₃₀=+138,8%, ІМ₃=+253,8%, р<0,05) в порівнянні з ІК.

При порівняльному вивченні ефектів різних доз аміксину (30 мг/кг та 3 мг/кг) було показано, що остання індукує найвищий рівень клітинної відповіді. Реакції природного імунітету (цитотоксичність ПКК і МФ) практично однаково активувались на 3-тю та 7-му доби експерименту, однак при застосуванні аміксину в дозі 3 мг/кг цей ефект був більш виражений. Відомо, що при формуванні клітинної імунної відповіді, в тому числі активації цитотоксичності ПКК та МФ, важливу роль відіграють як про- так і протизапальні цитокіни (ФНП, ІЛ-1, ІФН, ІЛ-4, ІЛ-10, ІЛ-12 тощо). Ми припустили, що зниження цитотоксичної активності ПКК з одночасним достовірним збільшенням цитотоксичності аутологічної СК на 16-ту добу після початку введення аміксину пов’язано зі зміною відповідного цитокінового спектру у СК мишей. Для підтвердження цього припущення було проведене порівняльне дослідження впливу аміксину на рівень продукції ФНП, ІЛ-1, ІФН та ІЛ-10 в СК та/або супернатантах спленоцитів дослідних мишей.

Як видно з табл. 5, титр ФНП в супернатантах культур, отриманих від інтактних тварин, становив 1,5±0,5 log2, а ІЦ супернатантів у розведенні 1:2 – 9,3±4,9%. На 3-тю добу після першого введення препарату відмічали суттєве збільшення титру та ІЦ ФНП в супернатантах спленоцитів мишей групи Аміксин-3, на 7-му добу ці показники були суттєво підвищеними в групі Аміксин-30. У віддалені терміни (16-та доба) відмічали підвищення титрів ФНП в супернатантах мишей обох груп.

Таблиця 5. Вплив різних доз препарату аміксин на продукцію ФНП прилипаючою фракцією спленоцитів мишей лінії C57BL/6

Група тварин	Доба після першого введення аміксину
	3-тя	7-ма	16-та
ІК	1,5±0,5 _______ 9,3±4,9
Аміксин-30 мг/кг	3,0±1,0 _______ 10,1±3,4	3,5±0,5* _______ 20,4±3,7*	2,5±0,5** _______ 15,8±0,6
Аміксин-3 мг/кг	3,0±0,02* _______ 26,9±2,1*	1,0±0,02 _______ 3,0±0,1	4,0±0,02* _______ 19,2±7,2

Примітка: * р<0,05 порівняно з ІК; ** 0,05<р<0,1 порівняно з ІК. У чисельнику – титр ФНП в супернатантах культур спленоцитів (log2); у знаменнику – ІЦ (%) супернатантів у розведенні 1:2.

При дослідженні здатності продукувати ІЛ-1 прилипаючими клітинами селезінки було показано, що у інтактних мишей спонтанна продукція цього цитокіну зберігалась до розведення 1:8 (4 log2). Цікавим виявився той факт, що у мишей, які отримували найменшу дозу аміксину (3 мг/кг), спонтанна продукція ІЛ-1 зберігалася до розведення 1:16 (5 log2) на 7-му та 16-ту добу спостереження, ІС при цьому дорівнював 4,6 та 6,5 відповідно (табл. 6). Останнє свідчить про здатність малих доз аміксину суттєво підвищувати функціональний резерв МФ селезінки.

Таблиця 6. Вплив різних доз препарату аміксин на продукцію ІЛ-1 прилипаючою фракцією спленоцитів мишей лінії C57BL/6

Група/показник		Розведення супернатантів
		2 log2	3 log2	4 log2	5 log2
Інтактні тварини	Спонтанний	11,9±8,0	7,4±4,0	5,2±2,8	0,0±0,0
	Кон А	39,9±15,0	16,9±5,5	11,3±3,8	9,7±4,6
	ІС, %	3,3	2,3	2,2	–
3-тя доба після першого введення аміксину
Аміксин-30 мг/кг	Спонтанний	4,7±0,1	1,1±0,1	0,0±0,0	0,0±0,0
	Кон А	10,2±1,9	4,1±2,6	0,0±0,0	0,0±0,0
	ІС, %	2,2	3,8	–	–
Аміксин-3 мг/кг	Спонтанний	15,1±1,3	6,8±4,5	6,6±4,8	1,5±1,2
	Кон А	15,2±4,1	9,2±4,1	4,5±2,4	0,5±0,1
	ІС, %	1,0	1,3	0,7	0,3
7-ма доба після першого введення аміксину
Аміксин-30 мг/кг	Спонтанний	20,5±0,7	3,4±1,0	0,0±0,0	0,0±0,0
	Кон А	70,8±10,0	48,8±1,2	28,1±1,2	17,7±2,3
	ІС, %	3,5	14,4	–	–
Аміксин-3 мг/кг	Спонтанний	26,2±10,1	17,4±6,2	9,3±1,6	1,8±1,4
	Кон А	89,0±33,4	54,8±17,6	26,9±11,8	8,3±2,1
	ІС, %	3,4	3,2	2,9	4,6
16-та доба після першого введення аміксину
Аміксин-30 мг/кг	Спонтанний	9,4±0,4	8,3±0,8	2,3±0,2	0,0±0,0
	Кон А	30,7±0,4	20,5±6,6	16,4±3,3	12,3±2,5
	ІС, %	3,3	2,5	7,3	–
Аміксин-3 мг/кг	Спонтанний	12,4±9,4	3,8±2,7	1,1±0,9	0,8±0,8
	Кон А	24,2±6,1	9,0±3,3	7,0±6,1	4,9±0,2
	ІС, %	1,9	2,4	6,2	6,5

Примітка: * ІС – індекс стимуляції.

Дані щодо впливу аміксину на вміст ІФН та ІЛ-10 в СК наведені в табл. 7. Слід зазначити, що використання відповідних доз аміксину мало певні особливості. Зокрема, рівень ІФН в СК мишей групи Аміксин-30 суттєво збільшився на 16-ту–22-гу добу після початку введення препарату (р<0,05). Такий ефект супроводжувався одночасним збільшенням вмісту ІЛ-10 в СК цих мишей (р<0,05). У мишей групи Аміксин-3 рівень ІФН в СК вже на 3-тю добу перевищував такий у ІК, а на 7-му добу – був достовірно вищий за показник ІК (р<0,05). На 16-ту добу рівень ІФН в СК мишей, які отримували аміксин, знизився і не визначався, тобто ми зафіксували, швидше за все, явище гіпореактивності [36], вихід з якого спостерігали на 22-гу добу. У цей період було зафіксоване повторне підвищення ІФН в СК мишей, які отримували аміксин (526,6±372,3 проти <15 пг/мл у ІК). Динаміка зміни рівня ІЛ-10 в СК мишей співпадає з такою ІФН: достовірне порівняно з ІК підвищення ІЛ-10 спостерігали на 16-ту добу, саме тоді, коли рівень ІФН в СК таких тварин не визначався (див. табл. 7). В інші терміни спостереження рівень ІЛ-10 в СК тварин цієї групи не відрізнявся від показника ІК. Здатність спленоцитів до продукції ІЛ-10 зберігалась протягом всього терміну спостереження і не мала достовірної різниці від показника ІК.

Таблиця 7. Рівень (пг/мл) ІЛ-10 та ІФН в СК та супернатантах спленоцитів інтактних та дослідних мишей лінії C57BL/6 в різні строки після курсового введення препарату аміксин

Показник		Інтактний контроль	Показник, доба після першого введення аміксину
			3-тя		7-ма		16-та		22-га
			Аміксин- 30 мг/кг	Аміксин- 3 мг/кг	Аміксин- 30 мг/кг	Аміксин- 3 мг/кг	Аміксин- 30 мг/кг	Аміксин- 3 мг/кг	Аміксин- 30 мг/кг	Аміксин- 3 мг/кг
ІЛ-10	СК	1096,2±126,9 (916,9÷1275,9)	981,2±47,7	1144,4±44,9	868,0±277,5	1504,0±480,2	1672,2±183,5*	1738,7±105,2*	1884,7±95,9*	960,2±469,9
	Супернатанти	1351,7±313,6 (908,4÷1795,4)	1067,2±216,0	1488,5±66,3	1294,4±140,4	663,2±153,1**	497,7±91,9*	1509,5±22,1	667,7±21,2**	578,7±76,4**
ІФН1	СК	<15	<15	138,1±83,8	<15	1192,3±360,5*	2607,9±16,8*	<15	1159,1±819,6	526,6±372,3
	Супернатанти	320,3±226,5 (0÷640,75)	538,8±7,5	133,5±109,0	449,4±186,3	<15	<15	474,4±166,2	<15	<15

Примітка: ¹ приведена аналітична чутливість тест-системи; * р<0,05 порівняно з ІК; ** 0,05<р<0,1 порівняно з ІК.

Слід відмітити, що підвищення рівня ІФН в СК на 3-тю та 7-му добу після початку введення аміксину співпадає з активуючим впливом СК на цитотоксичну активність ПКК і МФ та, швидше за все, обумовлює такий вплив СК на ефектори неспецифічного клітинного імунітету. Результати наших досліджень добре узгоджуються з даними літератури про активуючий вплив тилорону на активність МФ та ПКК [31, 37].

Підсумовуючи викладені результати, можна зазначити, що аміксин, введений тваринам у дозах 30 мг/кг, і особливо 3 мг/кг, спричинює виражений імуномодувальний ефект з пролонгованою дією, який реалізується за рахунок активації основних ефекторів неспецифічного захисту організму (ПКК, МФ), підвищення неспецифічної цитотоксичної активності СК, а також забезпечення збалансованого вмісту в СК ІФН та ІЛ-10.

Отримані результати дають підставу рекомендувати саме малі дози аміксину, зокрема 3 мг/кг, до використання в подальших експериментальних дослідженнях, спрямованих на вивчення механізмів його дії при включенні до схем протипухлинної вакцинотерапії.

Висновки

вверх

1. Субстанція аміксин має токсичну (в тому числі імунотоксичну) дію лише у дозі 500 мг/кг, дози 30 мг/кг та 3 мг/кг мають виражену імуномодулювальну дію.

2. Застосування аміксину в дозах 30 мг/кг та 3 мг/кг на 3-тю та 7-му добу після першого введення призводило до вірогідного підвищення цитотоксичної активності ПКК, а в подальшому – до накопичення в аутологічних СК гуморальних факторів, які забезпечують тривалу власну цитотоксичну активність таких сироваток. Слід зазначити, що при використанні аміксину в дозі 3 мг/кг такий ефект був більш виражений.

3. Триразове введення мишам низької дози (3 мг/кг) препарату аміксин підвищувало функціональну активність клітин моноцитарно-макрофагального ряду, про що свідчить достовірне збільшення на 3-тю і 16-ту добу титрів ФНП-активності супернатантів прилипаючої фракції спленоцитів таких тварин. Останнє обгрунтовує здатність малих доз аміксину суттєво підвищувати функціональний резерв МФ селезінки.

4. Застосування низької дози (3 мг/кг) препарату аміксин призводить до підвищення в СК мишей вмісту ІФН-γ, максимальний рівень якого визначається на 7-му добу після першого введення, а на 16-ту добу – рівня ІЛ-10, забезпечуючи збалансоване співвідношення зазначених цитокінів.

Література

1. Алиев М.А., Беляев Н.Н., Абзалиев К.Б. и соавт. Иммунологическая оценка эффективности применения ронколейкина в кардиохирургии при лечении инфекционного эндокардита // Цитокины и воспаление. – 2004. – № 3 (1). – С. 28-31.

2. Дворщенко О.С., Дiденко Г.В., Чередарчук О.I. і соавт. Моделювання ксеногенних клітинних систем на твердих фазах з використанням пухлиноасоцiйованих та ембрiональних антигенiв i їх застосування в протипухлинній терапії // Доповіді НАНУ. – 2007. – № 12. – С. 155-161.

3. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. – К.: Полиграф Плюс, 2010. – 552 с.

4. Ермольева З.В., Корнеева Л.Е., Балезина Т.И. и соавт. Тилорон как индуктор интерферона // Антибиотики. – 1973. – № 18 (6). – С. 517-520.

5. Ільїнська І.Ф. (2010) Застосування суміші омега-3 поліненасичених жирних кислот та молекулярного комплексу РНК – тилорон для корекції вакцинної відповіді на БЦЖ у тварин з макрофагальним імунодефіцитом // [Електронний ресурс]

URL http://www.ifp.kiev.ua/ftp1/original/2010/ilyinskaya2010.pdf.

6. Кавецкий Р.Е., Балицький К.П., Векслер И.Г., Ветрова Е.П. Тилорон – синтетический иммуностимулятор, обладающий противоопухолевой активностью // Вопросы онкологии. – 1977. – № 11. – С. 88-93.

7. Касихина Е.И. Клиническое применение тилорона дигидрохлорида: возможности и перспективы // Клин дерматол венерол. – 2012. – № 2. – С. 66-74.

8. Кожем’якін Ю.М., Хромов О.С., Філоненко М.А. та соавт. Науково-практичні рекомендації з утримання лабораторних тварин та роботи з ними. – Київ, 2002. – 179 с.

9. Летяева О.И., Гизингер О.А., Зиганшин О.Р. Вопросы эффективности и безопасности иммуномодулирующей терапии в лечении хламидийно-герпетической инфекции урогенитального тракта // Вестник дерматологии и венерологии. – 2012. – № 3. – С. 65-70.

10. Лісяний М.І., Скітяк С.А. Застосування аміксину в комплексному лікуванні гліом головного мозку // Лікарська справа. – 2002. – № 8. – С. 121-123.

11. Ляхов С.А., Литвинова Л.А., Андронати С.А. и соавт. Биохимические механизмы реализации противовирусной и интерферониндуцирующей активности амиксина и его аналогов // Укр. біохім. журн. – 2001. – № 73 (4). – С. 10-13.

12. Москвичов Є.П. Зміни структурно-функціонального стану мембран лімфоцитів в умовах курсового введення доксорубіцину та їх фармакологічна корекція // Інтегративна Антропологія. – 2013. – № 1 (21). – С. 25-29.

13. Москвичов Є.П., Рожковський Я.В. Вплив імуномодуляторів на показники оксидантно-антиоксидантної рівноваги в лімфоцитах мезентеріальних лімфатичних вузлів на фоні курсового уведення доксорубіцину // Досягнення біології та медицини. – 2013. – № 1 (21). – С. 15-20.

14. Пинчук В.Г., Балицький К.П., Векслер И.Г. и соавт. Противоопухолевая активность аналогов тилорона в их сочетании с цитостатическими препаратами // Химиотерапия опухолей в СССР. – 1983. – № 39. – С. 28-34.

15. Проданчук М.Г., Жмінько П.Г., Зінченко Д.В. та співавт. Дослідження імунотоксичної дії потенційно небезпечних хімічних речовин при їх гігієнічній регламентації: метод. рекоменд. – Київ, 2003. – 28 с.

16. Савцова З.Д., Усач О.М., Воєйкова І.М. та соавт. Особливості впливу протипухлинних вакцин (серія ІЕПОР), виготовлених за різними технологіями на ефекторні реакції специфічного та неспецифічного імунітету // Наукові записки НАУКМА. – 2001. – № 19. – С. 26-31.

17. Сенцова Т.Б. Иммуномодуляторы в общеврачебной практике Consilium medicum // Дерматовенерология. – 2006. – № 8 (10). – С. 65-67.

18. Сиденко А.В., Вишняков В.В., Исаев С.М. Теория статистики. Учебник. М: МАКС-Пресс, 2011. – 343 с.

19. Співак М.Я., Карпов О.В., Жолобак Н.М. та співавт. Індуктори інтерферону: від теорії до практики // Мікробіол. журн. – 2003. – № 65 (1-2). – С. 191-204.

20. Співак М.Я., Андронаті С.А., Ляхов С.А. и др. Індуктори інтерферону як противірусні агенти: нові аспекти старої проблеми // Журнал органічної та фармацевтичної хімії. – 2007. – № 1 (7). – С. 4-20.

21. Степанова Т.Ю., Філіпова Т.О., Галкін Б.М. Вплив тилорону на рівень ФНП- α, ІФН-γ та ІЛ-10 у тканинах мишей з експериментальним алергічним енцефаломієлітом // Досягнення біології та медицини. – 2010. – № 1 (15). – С. 17-20.

22. Стефанов О.В. Доклінічні дослідження лікарських засобів (методичні рекомендації). К.: Авіцена, 2001. – 527 с.

23. Тєрьошина І.Ф. Вплив сучасного імуноактивного препарату аміксину на інтерфероновий статус хворих на рекурентнй депресивний розлад, триваючий епізод тяжкий без психотичних симптомів при лікуванні в амбулаторних умовах // Український морфологічний альманах. – 2011. – № 9 (4). – С. 107-110.

24. Ткаченко І., Гаркава К., Карпов О. Імунотропні властивості молекулярного комплексу дріжджова РНК–тилорон гідрохлорид, індуктора інтерферонів першого типу // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. – 2005. – № 39. – С. 141-147.

25. Філіпова Т.О., Головенко М.Я. Тилорон: профіль біологічної активності і фармакологічні властивості // Інтегративна антропол. – 2006. – № 7 (1). – С. 18-23.

26. Чижов Н.П., Смольская Т.Т., Байченко П.И. и соавт. Клинические исследования переносимости и интерферониндуцирующей активности амиксина // Вопр. вирусол. – 1990. – № 35 (5). – С. 411-414.

27. Шай Д.С., Жолобак Н.М., Ляхов С.А. та співавт. Інтерфероногенна активність аналогів аміксину і похідних дифенілу // Мікробіол. журн. – 2007. – № 69 (5). – С. 59-64.

28. Anuradha B., Santosh C.M., Hari Sai Priya V. et al. Age-related waning of in vitro Interferon-γ levels against r32kDaBCG in BCG vaccinated children // Journal of Immune Based Therapies and Vaccines. – 2007. – Vol. 5. – Р. 8.

29. Cummings F.J., Gelman R., Skeel R.T., et al. Phase II trials of Baker’s antifol, bleomycin, CCNU, streptozotocin, tilorone, and 5-fluorodeoxyuridine plus arabinosyl cytosine in metastatic breast cancer // Cancer. – 1981. – Vol. 48 (3). – P. 681-685.

30. Fisch H., Gifford G. In vitro prpduction of rabbit macrophage tumor cell cytotoxin // Int J Cancer. – 1983. – Vol. 32 (1). – P. 105-112.

31. Gaforio J.J., Ortega E., Algarra I. et al. NK cell mediate increase of phagocytic activity but not of proinflammatory cytokine (interleukin-6[IL-6], tumor necrosis factor alpha, and IL-12) production elicieted in splenic macrophages by tilorone treatment of mice during acute systemic candidiasis // Clin Diagn Lab Immunol. – 2002. – Vol. 9 (6). – P. 1282-1294.

32. Itoh K., Yamada A., Mine T., Noguchi M. Recent advances in cancer vaccines: an overview // Jpn J Clin Oncol. – 2009. – Vol. 39 (2). – P. 73-80.

33. Potebnya G.P., Lisovenko G.S., Trokhimenko N.V., Cheremshenko N.L., Didenko G.V., Reder А.S., Andronati S.A. Elevation of efficacy of cancer vaccine combined with interferon and inducer of endogeneous interferon synthesis amixin // Exp Oncol. – 2008. – Vol. 30 (4). – P. 319-323.

34. Soroka Yu.V., Demkiv I.Ya., Lisnychuk N.Ye. Мarkers of endogenic intoxication and state of immune system of white rats at chronic neoplastic intoxication // Таврический мед-биол. вестник. – 2012. – № 15 (3). – С. 308-310.

35. Stanojkovic T.P., Zizak Z., Srdic T. et al. The antitumor immune response in HER-2 positive, metastatic breast cancer patients // J Transl Med. – 2005. – Vol. 3. – P. 13.

36. Stringfellow D.A. Induction of interferon with low molecular weight compounds: fluorenone esters, ethers (tilorone), and pyrimidinones // Methods Enzymol. – 1981. – Vol. 78. – С.262-284.

37. Turner E.V., Wallace J.H. Tilorone-mediated protection against murine B16 melanoma. Proc Soc Exp Biol Med. – 1981. – Vol. 167 (4). – P. 536-541.

38. Vahlne G., Becker S., Brodin P., Johansson M.N. IFN-gamma production and degranulation are differentially regulated in response to stimulation in murine natural killer cell // Scand J Immunol. – 2008. – Vol. 67 (1). – P. 1-11.

39. Weiss J.N., Ochs A.L., Abedi S. et al. Retinopathy after tilirone Hydrochloride // Am J Ophtalmol. – 1980. – Vol. 90 (6). – P. 846-853.

40. Zinkovsky V.G., Zhuk O.V., Sumriy S.K. Pharmacokinetics of a synthetic interferon inducer amixin in mice // Pharmacol Reports. – 2007. – Vol. 59. – P. 739-751.