Перспективы изучения и применения микроРНК в иммунологии и аллергологии

И.П. Кайдашев, Украинская медицинская стоматологическая академия, г. Полтава

Современная медицина особое внимание уделяет двум перспективным областям: диагностике заболеваний и генной терапии. Несмотря на существенные достижения в диагностике ряда патологий, проблемы раннего выявления, особенно онкологических заболеваний, продолжают волновать медицинскую общественность. Генная терапия представляет собой новейшую технологию лечения генопосредованных заболеваний, сформировавшуюся на рубеже 80-90-х гг. прошлого столетия. На сегодня проведено более чем 100 клинических исследований, посвященных лечению аутосомно-доминантных и аутосомно-рецессивных одногенных заболеваний (гемофилия и цистофиброз) и некоторых форм злокачественных новообразований (опухоли мозга, рак кишечника) [1]. Тем не менее, вследствие возможной токсичности доставляемых фрагментов генов, проблем с эффективностью носителей и других ограничений потребуется еще немало времени, для того чтобы генная терапия стала зрелой технологией в лечении заболеваний человека.

Сегодня описан большой класс малых РНК, названный микроРНК, который может обеспечить прорыв в этой области. Несмотря на то что микроРНК описаны всего несколько лет назад, они стали наиболее важными регуляторами активности генов на посттрансляционном уровне. Исследования показали, что микроРНК регулируют экспрессию более чем 30% генов, кодирующих структуру белков [2, 3]. МикроРНК играют важную роль в многочисленных метаболических и биологических процессах, несмотря на то что функции большинства из идентифицированных микроРНК остаются не установленными [4]. Последние исследования показали, что существует уникальный профиль экспрессии микроРНК в различных опухолях в разных стадиях развития. Такие ткань-специфические профили экспрессии микроРНК могут выполнять важные функции при многих заболеваниях и вирусных инфекциях.

Предполагают, что микроРНК могут служить новыми биомаркерами в диагностике заболеваний и обеспечить новую стратегию генной терапии с использованием технологий микроРНК.

История изучения, биогенез и регуляторные механизмы микроРНК

Впервые микроРНК были охарактеризованы исследовательской группой под руководством V. Ambros из Гарвардского университета в 1993 г. [5]. Начало этому было положено установлением мутации у нематод Caenorhabditis elegance, которая приводила к нарушению превращения куколки во взрослое животное. После более чем 10-летнего исследования белка, ответственного за развитие этого феномена, была обнаружена малая некодирующая белок РНК, названная lin-4, которая была необходима для развития фенотипа данной мутации. Дальнейшие исследования показали, что lin-4 отрицательно контролирует экспрессию гена lin-14 путем присоединения к 3’нетранслируемой области (3’-UTR) lin-14 тРНК через несмысловое взаимодействие РНК-РНК [6]. Тем не менее, важные функции микроРНК оставались неизвестными до открытия другой микроРНК (let-7), выявленной у множества организмов [7], и открытия большого класса похожих малых РНК у С. еlegance, Drosophila melanogaster и у человека [8-10]. С тех пор исследование микроРНК стало одной из наиболее актуальных тем в биологии и медицине. Как показывают исследования, микроРНК присутствуют и функционируют во всех биологических и метаболических процессах эукариот. На сегодняшний день в базах данных идентифицировано около 5 тыс. микроРНК [12].

МикроРНК являются классом малых РНК длиной 19-24 нуклеотидов, которые не кодируют синтез белка. МикроРНК могут быть закодированы в любом участке генома. Большинство (61%) генов микроРНК расположено в областях интронов белоккодирующих генов, тем не менее, гены микроРНК могут быть локализованы в области экзонов или межгенных областях. МикроРНК транскрибируются с генов, названных генами микроРНК, с помощью РНК-полимеразы II (pol II), некоторые – с помощью pol III. Биогенез микроРНК намного сложнее, чем тРНК, и является многоступенчатым процессом, в котором участвует множество ферментов. В начале с генов микроРНК транскрибируются первичные микроРНК с 5’ и 3’поли(А)концами с помощью pol II или pol III. Некоторые микроРНК-гены транскрибируются поодиночке, а некоторые образуют кластеры, которые котранскрибируются вместе как один полицистронный транскрипт. Длина первичных микроРНК колеблется от нескольких десятков до более тысячи нуклеотидов. Затем первичные микроРНК распознаются микропроцессорным комплексом, который образован ядерной РНКазой III Drosha вместе с ее партнером – областью 8, критической для синдрома Ди-Джорджи (DGCR8), имеющей домен, связывающий двухспиральную РНК (dsRBD). После этого они разрезаются на предшественники микроРНК с приблизительно 70-нуклеотидной стеблепетлевой структурой [13]. Предшественники микроРНК с вторичной структурой транспортируются в цитоплазму транспортером экспортин 5, и процесс является Ran-GTP-зависимым [14]. В цитоплазме предшественники микроРНК процессируются в 19-24-нуклеотидные двухцепочечные микроРНК: микроРНК-комплексы с помощью другого фермента РНКазы III, названного Dicer, вместе с его dsRBD-партнером TRBP [15]. После этого зрелые последовательности микроРНК поступают в РНК-индуцируемый заглушающий комплекс (RISC) и воздействуют на экспрессию отдельных генов. Последовательности противоположной цепи микроРНК разрушаются с помощью пока не известных механизмов (см. рисунок).

Существует много общего между микроРНК и другими РНК, особенно малыми РНК. Для того чтобы РНК была отнесена к классу микроРНК, она должна иметь следующие характеристики [16]: все зрелые микроРНК образуются из длинных предшественников микроРНК вследствие множества превращений, хотя относительно некоторых микроРНК червей и плодовых мушек может наблюдаться несколько иной механизм; предшественники микроРНК могут быть преобразованы во вторичные шпилечные структуры с высокоотрицательной минимальной структурной свободной энергией; микроРНК расположены внутри одного плеча вторичной шпилечной структуры; не имеется внутренних петель или выпячиваний в комплексе микроРНК:микроРНК. В микроРНК допускается небольшое количество несовпадений, но имеется по меньшей мере 16 пар оснований между микроРНК и их последовательностями микроРНК. Некоторые микроРНК весьма консервативны для разных видов [17], хотя не существует универсальных характеристик для всех микроРНК. Имеется также много видоспецифичных микроРНК. Перечисленные критерии для идентификации микроРНК касаются их биогенеза. Кроме критериев биогенеза при разработке новых микроРНК необходимо наличие как минимум одного из следующих критериев: микроРНК должны экспрессироваться и определяться, по крайней мере, в одном органе или ткани общепринятыми методами молекулярной биологии – northern блоттинг, микроплатформы и/или ПЦР в реальном времени; экспрессия микроРНК изменяется при сниженной экспрессии ферментов биогенеза микроРНК – Dicer и Drosha.

В последние 7 лет резко возросло внимание к проблеме микроРНК, что подтверждается множеством публикаций в различных журналах [18]. Согласно данным базы микроРНК, общее количество известных микроРНК возросло с 218 в 2002 г. до 5 071 в 2007 г. [11, 12]. Несмотря на то что первая микроРНК была идентифицирована в 1993 г., их функции оставались неизвестными до начала ХХІ в., когда они были определены у представителей трех различных видов. В настоящее время для человека описано более 400 микроРНК, а применение компьютерных программ позволило предсказать наличие более 1 000 генов микроРНК в геноме человека [19]. МикроРНК широко распространены в организме эукариот и у некоторых вирусов. Они регулируют экспрессию более 30% генов, кодирующих информацию о структуре белков, что делает их одними из наиболее важных генных регуляторов.

МикроРНК контролируют множество биологических и метаболических процессов: от развития органов, тканей и сигнальной трансдукции до заболеваний, вызванных опухолевыми процессами и вирусом иммунодефицита.


Новые современные технологии, примененные к идентификации генов микроРНК и их мишеней, такие как компьютерные программы, предсказывающие микроРНК и их мишени, ПЦР в реальном времени и микроРНК микроплатформы, позволяют лучше изучить и понять функции микроРНК. Все это свидетельствует о том, что микроРНК имеют значительный потенциал для клинического применения – в диагностике заболеваний и генной терапии.

Сегодня описаны три основных механизма генной регуляции с помощью микроРНК: репрессия трансляции, прямая деградация мРНК и микроРНК-опосредованное разрушение мРНК [20, 21]. Выбор механизма регуляции зависит от степени комплементарности микроРНК к ее мРНК-мишени. Хотя и микроРНК, и малые интерферирующие РНК (siРНК) входят в RISK и ингибируют экспрессию генов на посттрансляционном уровне, их взаимодействие с мРНК имеет различные механизмы. SiРНК преимущественно присоединяются к мРНК-мишени и проводят эндонуклеолитическое расщепление с помощью RISK [22]. МикроРНК в большинстве случаев�связываются с неполной коплементарностью с мРНК-мишенью и осуществляют репрессию трансляции мРНК [23, 24]. Тем не менее, сейчас известны несколько микроРНК, которые прямо разрушают мРНК-мишени. Например, микроРНК-196 непосредственно разрушает мРНК белка HOXB8, играющего важную роль в развитии животных организмов [25]. Точные механизмы репрессии трансляции с помощью микроРНК по-прежнему остаются до конца не изученными, но одним из возможных механизмов может быть ингибирование комплексом микроРНК-RISK процессов инициации и/или элонгации трансляции белка путем взаимодействия с различными трансляционными факторами, такими как elF4F [26]. Кроме того, показано, что микроРНК воздействуют на экспрессию генов путем направленного разрушения мРНК с помощью деаденилирования РНК-мишеней [27], которое полностью отличается от нормальной репрессии трансляции и/или прямой деградации мРНК. Известно, что 3’поли(А)хвосты и 5’головки очень важны для обеспечения стабильности мРНК и препятствуют разрушению последних. После того как микроРНК приводит к удалению 3’поли(А)хвоста и 5’головки у мРНК-мишени, наступает быстрое разрушение такой мРНК клеточными ферментами.

В большинстве случаев микроРНК присоединяется к мРНК-мишени на 3’UTR с многочисленными участками. Однако микроРНК, направленная на 3’UTR и/или открытую считывающую рамку, также может репрессировать генную экспрессию. Первично микроРНК взаимодействуют с 6-8 нуклеотидами на своем 5’конце с мРНК-мишенью. Эта область микроРНК получила название «seed»-области (от англ. seed – семя, зерно) и является высоко консервативной для одного семейства микроРНК у разных видов [28]. Указанная особенность используется для разработки различных компьютерных программ с целью создания новых микроРНК и поиска их мишеней.
Роль микроРНК в развитии заболеваний у человека, возможность их использования в диагностике и в качестве биомаркера рака
Накапливается все больше доказательств важной роли микроРНК в генезе многих заболеваний: от рака и ВИЧ-инфекции до метаболических нарушений. Открыты уникальные наборы микроРНК, специфичные для разных заболеваний, уникальная экспрессия микроРНК при определенных заболеваниях и, наконец, аберрантная экспрессия микроРНК при патологическом процессе.
Рак

Впервые участие микроРНК в развитии онкологических заболеваний было показано для двух генов микроРНК miR-15 и miR-16, расположенных в хромосомной области 13q14. Наблюдалась частая делеция или репрессия этих генов у 68% пациентов с хронической В-лимфоцитарной лейкемией [29].

Последующие исследования показали, что в большинстве случаев многие формы онкопатологии (рак легких, лейкемия, рак молочной железы и мозга) имеют альтернативный профиль экспрессии микроРНК по сравнению с нормальными соответствующими тканями. Получены важные данные о том, что раковая инвазия и метастазирование инициируются микроРНК [30].

Сегодня данные об экспрессии микроРНК при онкопатологии изложены во многих работах. Суммируя эти сведения, можно заключить, что для каждого типа рака аберрантно экспрессированы как минимум две микроРНК. Возможна либо повышенная экспрессия отдельных микроРНК, при этом микроРНК функционирует как онкоген, либо сниженная экспрессия, и при этом микроРНК выступает как ген, супрессирующий развитие опухоли. Важно также то, что некоторые микроРНК имеют различный профиль экспрессии при разных типах рака [55]. Более того, по мере развития опухоли меняется и профиль экспрессии микроРНК.

Накопленные знания позволяют рассматривать микроРНК в качестве нового биомаркера ранней диагностики рака в клинической практике.

Применение микроРНК явилось существенным достижением в характеристике низкодифференцированных новообразований, примером чего явилось создание нового метода оценки профиля экспрессии микроРНК с помощью проточной цитометрии (с использованием меченых частиц) для анализа 17 низкодифференцированных опухолей. При этом точность анализа была очень высокой и позволила идентифицировать гистологически недифференцируемые новообразования. В литературе описано множество исследований, которые еще раз подтверждают вышеизложенное, интересующийся читатель легко найдет эти данные.
Метаболические заболевания

В последние десятилетия заболевания обмена веществ (например сахарный диабет) приобретают характер глобальной проблемы и требуют разработки действенных мер профилактики и лечения. Любой процесс, нарушающий обмен веществ, может вызвать заболевание обмена веществ. И хотя этот тезис выглядит спорным, следует признать, что даже если одно случайное воздействие и не вызовет заболевания, то сумма процессов, действующих на восприимчивый организм, с большой вероятностью приведет к развитию патологии.

В нескольких исследованиях показано, что микроРНК могут иметь непосредственное отношение к регуляции обмена веществ и играть важную роль в этих процессах. Впервые это было доказано на плодовых мушках [81]: ослабление функций miR-14 существенно увеличивало общее содержание триацилглицеридов, при этом сохранялась клеточная архитектоника, в адипоцитах липидные капли были сильно увеличены. Усиление экспресии miR-14 приводило к исчезновению этого феномена и снижению концентрации триацилглицеридов. Последующие исследования показали, что miR-278 осуществляет контроль продукции инсулина, а делеция miR-278 стимулирует данный процесс [32]. Важные данные получены относительно роли miR-375, специфичной для островковых клеток, в регуляции глюкозозависимой секреции инсулина [32]. Таким образом, по крайней мере, две эти микроРНК могут быть мишенями для новых терапевтических стратегий при сахарном диабете.

Описана микроРНК miR-122, которая регулирует обмен липидов в печени. При ингибировании этой микроРНК у мышей с помощью антисмысловой олигонуклеотидной технологии наблюдалось снижение уровня холестерина в плазме крови и улучшение состояния печени при стеатозе. На этой же модели был применен новый класс ингибиторов микроРНК, названный антагомиры (antagomirs), для выключения miR-122 [33].

Также микроРНК могут принимать участие в регуляции метаболизма аминокислот. Например, miR-29b контролирует синтез аминокислот с участием альфа-кетокислотного дегидрогеназного комплекса. Учитывая, что многие болезни обмена веществ человека связаны со специфическими нарушениями синтеза аминокислот, отдельные специфические микроРНК могут быть терапевтическими мишенями.
Вирусные инфекции
Широко известен факт, что растения и некоторые животные организмы используют путь РНК-интерференции для защиты от вирусных инфекций [34]. В настоящее время получены данные о способности микроРНК с генным регуляторным механизмом, схожим с РНК-интерференцией, участвовать в ответе организма на вирусную инфекцию [35]. Многие микроРНК обнаружены у таких вирусов, как ВИЧ, вирус Эпштейна – Барр (ВЭБ), цитомегаловирус (ЦМВ) [41, 42], хотя механизм образования вирусной микроРНК остается неясным.

Одной из важных функций микроРНК является контроль репликации вируса во время инфицирования клетки и его персистенции.


 Например, вирус гепатита С (ВГС) является малым (50 нм) одноцепочечным РНК-содержащим вирусом, принадлежащим к семейству Flaviviridae и представляющим собой одну из наиболее частых причин хронических заболеваний печени. Обнаружено, что miR-122, специфичная для печени, модулирует репликацию ВГС и накопление вирусной РНК, а выключение miR-122 с помощью антагомира антисмыслового 2’-O-метилированного РНК-олигонуклеотида (2’-OМe-анти-miR-122) приводило к 80% снижению количества автономно реплицирующейся вирусной РНК. Таким образом, miR-122 представляет собой перспективную мишень для антивирусной терапии путем противодействия быстро включающемуся вирусному геному.

Кроме того, существует очень важный механизм, при котором микроРНК хозяина могут сами по себе ограничивать вирусные инфекции и защищать клетки.

Установлено, например, что клеточная miR-32 эффективно ограничивает накопление ретровируса PFV-1 в клетках человека, воздействуя на белок Tas, кодирующийся вирусом PFV-1 [35].
Заболевания иммунной системы

Как было показано ранее, многие регуляторы экспрессии генов могут выступать мишенями для иммунной системы при развитии аутоиммунных заболеваний.

Пациенты с системными аутоиммунными заболеваниями, как правило, продуцируют аутоантитела против эволюционно консервативных комплексов. Достаточно часто белки-мишени либо могут сами по себе связывать РНК, либо соединяются с белками, способными связывать РНК. Реже в качестве мишеней выступают белки, связывающие ДНК. Часто прототипы-аутоантигены называют инициалами пациентов, у которых были выявлены соответствующие аутоантитела. Примером тому являются аутоантигены Sm, Ro, La, Th/To, которые в дальнейшем были уточнены как сплайсеосома U малые ядерные рибонуклеопротеиновые частицы, Y-РНК-содержащие Ro-рибонуклеопротеиновые частицы, РНК-связывающий La-белок и РНКазаMRP/РНКаза Р эндонуклеазы соответственно.

Получены новые данные, согласно которым компоненты РНК-интерферирующего пути также могут распознаваться аутоантителами, названными ранее анти-Su-антителами. Молекулярная структура и биологические функции Su-аутоантигена долгие годы оставались не раскрытыми. С помощью современных методов иммуноцитохимии и иммунопреципитации было показано, что Su представляет собой макромолекулярный комплекс, ассоциированный с GW182 путем РНК-интерференции. Сыворотка к Su распознает несколько членов семейства белков-аргонавтов, которые связаны с RISC [36]. В конце концов, один из компонентов Su был идентифицирован как Dicer. Как описано выше, этот белок превращает предшественник – двухспиральную РНК – в функционально активные микроРНК и миРНК.

Впервые анти-Su-антитела были обнаружены при системной красной волчанке, а затем – при многих ревматических заболеваниях [37, 38].

Логично, что микроРНК могут иметь отношение и к развитию аллергических заболеваний, в частности такого распространенного заболевания, как бронхиальная астма (БА).

Было показано, что неклассическая молекула главного комплекса гистосовместимости HLA-G обладает важными иммуномодулирующими свойствами, а ее гаплотип связан с риском развития БА. Впоследствии были получены данные о том, что однонуклеотидный полиморфизм в 3’ нетранслируемой области HLA-G влияет на направленность трех микроРНК (miR-148a, miR-148b, miR-152) на этот ген, и такая аллель-специфическая направленность связана с риском развития БА [39].

Следует отметить, что такой фундаментальный процесс, как дифференцировка Т-, В-клеток и т. д., не может не включать регуляторных механизмов с участием микроРНК.

Действительно, установлено участие микроРНК miR-16, miR-21, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-150, miR-15b, Let-7f в процессах дифференцировки наивных, эффекторных CD8 Т-клеток и CD8 Т-клеток памяти [40].
Другие заболевания
Кроме перечисленных выше участие микроРНК обнаружено в патогенезе многих других заболеваний человека. При гипертрофии миокарда наблюдается снижение экспрессии miR-1, miR-133; при болезни Альцгеймера – снижение miR-124а и повышение miR-9 и miR-128; при псориазе – повышение miR-203, miR-146а, miR-21 и miR-125b; при синдроме Туретта – повышение miR-189; при болезни Паркинсона – снижение miR-133b; при шизофрении – изменение miR-130b [55].
МикроРНК как мишени генной терапии
Онкопатология
На сегодня опухолевые заболевания остаются наиболее важной проблемой клинической медицины, несмотря на успехи, достигнутые в хирургических, химиотерапевтических и радиологических методах лечения. По-прежнему при некоторых опухолях отмечается очень низкая частота излечения.

Специфические изменения экспрессии некоторых микроРНК при опухолевых заболеваниях предполагают, что такие микроРНК могут выступать в качестве мишеней для генной терапии опухолей.

Например, Let-7 представляет собой важную микроРНК при раке легких. Показано, что эта микроРНК ассоциирована с патогенезом рака легких, и ее экспрессия достоверно снижена в тканях, пораженных данным процессом. Снижение экспрессии Let-7 коррелирует с уменьшением сроков выживания после хирургического лечения, независимо от стадии заболевания. Временное повышение экспрессии Let-7 в клетках культуры легочной аденокарциномы ингибировало их пролиферацию. Согласно результатам современных исследований, Let-7 ингибирует рост опухоли, воздействуя на несколько онкогенов RAS и HMGA2 [43].

Эти результаты свидетельствуют о перспективности изучения микроРНК Let-7 в качестве ингибитора при раке легких и обосновывают необходимость проведения экспериментальных и клинических исследований.
Кардиологические заболевания
Кардиологические заболевания являются одной из ведущих причин заболеваемости и смертности в развитых странах, поэтому поиск новых способов профилактики и лечения данной патологии остается одной из важнейших проблем теоретической и клинической медицины.

Последние исследования показали, что микроРНК принимают участие в развитии сердечно-сосудистой системы, обеспечении сократимости миокарда, и при некоторых заболеваниях наблюдается аберрантная экспрессия определенных микроРНК [45].

Повышенная экспрессия miR-1, специфической для сердца, ингибирует кардиомиоциты во время его эмбриогенеза [44] и провоцирует аритмогенез [44]. Это подчеркивает важную патофизиологическую роль указанной микроРНК при сердечной недостаточности и возможность рассмотрения miR-1 в качестве мишени для антиаритмической генной терапии.

Другая микроРНК – miR-133 – ассоциирована с гипертрофией миокарда: повышение экспрессии miR-133 ингибирует гипертрофический синдром в кардиомиоцитах взрослых и новорожденных, и, наоборот, ингибирование miR-133 приводит к усилению гипертрофии сердца у мышей. Таким образом, miR-133 может служить мишенью для предотвращения развития гипертрофии миокарда.
Стратегии направленного воздействия на микроРНК
Создание молекул, направленных на микроРНК
Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО)
и их создание являются мощной технологией для выборочного изменения экспрессии генов как in vitro, так и in vivo. В последние годы технология АСО была успешно применена в клинической практике для генной терапии некоторых заболеваний [46]. В соответствии со специфическими характеристиками микроРНК, АСО химически модифицированы в одноцепочечные РНК-аналоги, комплементарные к специфической микроРНК. Таким модифицированным АСО дано название анти-микроРНК АСО, сокращенно – АМО. Кроме того, существует название антагомиры [33]. В последние годы проведено множество исследований по ингибированию активности микроРНК с помощью АМО/антагомиров, в том числе в клинической практике.

Наиболее известно первое сообщение об ингибировании микроРНК при использовании АМО, комплементарных к 11 микроРНК, введенных эмбрионам дрозофилы. При этом наблюдалось множество дефектов развития. Затем были выполнены работы по повышению связывающей способности АМО. Наиболее эффективным оказалось присоединение химической группы к 2’-гидроксильной группе, АСО, закрывающим нуклеиновым кислотам (ЗНК) и АСО с фосфоротиоатной модификацией. Наиболее успешны модификации с добавлением химической группы к 2’-гидроксильной группе 2’-О-метильной, 2’-О-метоксиэтильной и 2’-флюорильной групп. Этот процесс замедляет расщепление нуклеазами и увеличивает аффинность связывания с микроРНК.

Введение антагомиров с 2’-О-метильной модификацией к трем микроРНК (miR-16, miR-192, miR-194) приводило к существенному снижению экспрессии этих микроРНК в 11 различных органах/тканях (печень, легкие, почки, сердце, кишечник, жировая ткань, кожа, костный мозг, мышцы, яичники и надпочечники) [33].

ЗНК, модифицированные АСО, структурно отличаются от АСО 2’-О-модификацией. В ЗНК, модифицированных АСО, 2’-кислород является мостиком к 4’-положению рибозы через метиленовый соединитель для образования жесткого биоцикла [47]. Такие ЗНК-структуры имеют беспрецедентную аффинность, хорошую способность различать несовпадения, низкую токсичность и повышенную метаболическую стабильность, благодаря чему начинают широко применяться в живых организмах. Комбинации 2’-О-метильной модификации АСО и ЗНК применены для ингибирования miR-21, что позволяет изучить функции микроРНК в прогрессии апоптоза клеток человеческой глиобластомы [48].

Таким образом, создание различных модификаций АСО представляет собой мощный инструмент в ингибировании активности специфических микроРНК и реальную терапевтическую стратегию в лечении многих заболеваний, в том числе рака.

Доставка молекул в специфические участки органов и тканей

Успех терапии, направленной на микроРНК, в значительной степени зависит от эффективных систем доставки АСО/АМО/антагомиров в органы-мишени. Последние 5 лет в клиническую практику внедряется генная терапия путем РНК-интерференции [50]. Поскольку генная терапия, производимая как путем РНК-интерференции, так и микроРНК, базируется на развитии антисмысловых препаратов, которые выключают экспрессию генов после транскрипции, и, кроме того, микроРНК химически идентичны малым интерферирующим РНК (миРНК), все методы теоретически могут быть применены для доставки молекул при микроРНК-направленной терапии.

Установлено, что микроРНК и миРНК, конъюгированные с холестерином, могут попадать в клетку и «заставлять молчать» отдельные гены. Показано, что эффективность доставки миРНК в клетку зависит от взаимодействия с липопротеидными частицами, липопротеидными рецепторами и трансмембранными белками. Конъюгация миРНК с липофильными молекулами повышает эффективность ее доставки в клетку. Липопротеиды высокой плотности транспортируют микроРНК в печень, кишечник, почки и органы стероидогенеза, липопротеиды низкой плотности – преимущественно в печень. Таким образом, эти молекулы-носители обеспечивают возможность доставки микроРНК в определенные ткани.

В качестве векторов для доставки миРНК и/или коротких шпилечных РНК (кшРНК) в клетки широко используются вирусы. Например, модифицированный аденовирус, аденоассоциированный вирус (ААВ) и лентивирус успешно применены для доставки миРНК/кшРНК в геном-мишень [51]. Для исследования функций микроРНК и антагомириндуцированного «заглушивания» гена в аденовирусный геном были введены miR-122 и антагомиры и затем трансфецированы мышам путем прямой внутривенной инъекции.

В настоящее время несколько компаний разработали ряд РНК-интерферирующих векторов, которые могут быть использованы для доставки микроРНК в клетки и интеграции в геном. Все больше исследователей сегодня заняты разработкой коммерческих векторов для доставки микроРНК в клетки.

Перспективы изучения микроРНК
Ранняя диагностика рака
Несмотря на то что многие исследования убедительно доказали возможность применения профиля экспрессии микроРНК для идентификации и классификации малодифференцированных опухолей, многое еще предстоит сделать для применения этой методики в клинической практике. Сегодня большинство исследований направлено на сравнение профилей экспрессии микроРНК в опухолевой и соответствующей здоровой ткани, но не менее перспективным является определение профилей экспрессии микроРНК в разных субтипах опухолей.

Метод проточной цитометрии микроРНК с использованием микрочастиц был успешно применен для диагностики четырех субтипов рака молочной железы [31]; метод ПЦР в реальном времени использовали для установления различных стадий рака яичника, молочной железы на основе профилей экспрессии микроРНК. Привлекательным подходом является исследование профиля экспрессии микроРНК в крови пациентов и выявление корреляций с профилями экспрессии микроРНК в опухолевой ткани. Такие исследования могут иметь неоценимое значение в ранней диагностике опухолей по анализу периферической крови.

Доставка микроРНК и/или анти-микроРНК для генной терапии

Методы РНК-интерференции применяются уже несколько лет, что обусловливает развитие средств доставки миРНК в клетки. Тем не менее, необходима разработка новых стратегий, основанных на уникальных характеристиках и малых размерах микроРНК. Наибольшим достижением микроРНК-терапии явилась доставка микроРНК/анти-микроРНК в специфические ткани и их экспрессия в определенное время для воздействия на отдельные гены при ограничении/минимизации влияния на другие ткани.

Несмотря на то что применение АСО/АМО характеризуется мощным эффектом, блокирующим микроРНК, механизм «заглушивания» генов остается неясным. Поняв этот механизм, мы откроем новые, более широкие перспективы клинического применения АСО/АМО.

Важным представляется открытие того, что определенные ткани являются нечувствительными к микроРНК-терапии. Возможно, такая нечувствительность объясняется наличием гематоэнцефалического барьера, так как системная инфузия антагомира не изменяет уровня микроРНК в головном мозге [49]. Это обусловливает необходимость разработки новых стратегий доставки, например для опухолей мозга.
Возможные токсические эффекты генной терапии с применением микроРНК/анти-микроРНК
Перед широким клиническим применением миРНК необходимо как можно более полно изучить возможные токсические эффекты и иммунный ответ на микроРНК/анти-микроРНК. На ранних этапах генной терапии введенные векторы и гены могут индуцировать воспалительный ответ у некоторых пациентов вследствие дозозависимой индукции врожденного и адаптивного иммунного ответа [52]. Наиболее серьезным побочным эффектом после переноса аденовирусного генома является развитие системного воспалительного ответа, не совместимого с жизнью.

Вопрос о том, всегда ли введение микроРНК приводит к активации врожденного и приобретенного иммунного ответа, остается открытым, так как проведено еще очень мало экспериментальных исследований и клинических наблюдений. При генной терапии достаточно большое количество микроРНК вводится в клетки, и еще не известно, сколько микроРНК необходимо ввести, чтобы воздействовать на внутриклеточные механизмы. Существуют данные, что избыточная экспрессия кшРНК у мышей воздействует на внутриклеточные механизмы, но приводит к тяжелым токсическим поражениям печени. Возможно, что введение больших количеств микроРНК вызывает ингибирование по типу обратной связи. А это, в свою очередь, приводит к нарушению нормального синтеза микроРНК. 

Многие современные исследования являются краткосрочными, поэтому в дальнейшем необходимо изучить эффекты длительного воздействия микроРНК/

анти-микроРНК на организм. Например, было показано, что кратковременное блокирование miR-122 может быть возможным терапевтическим подходом в лечении ВГС. Однако оказалось, что длительное блокирование этой микроРНК ассоциировано с неопластической трансформацией в клетках грызунов и человека [53]. Это подчеркивает необходимость дальнейших экспериментальных исследований микроРНК, предваряющих клинические испытания.
Возможное воздействие микроРНК на другие гены (не гены-мишени)

Многие микроРНК имеют сотни консервативных мишеней и, кроме того, дополнительные неконсервативные мишени [54]. МикроРНК регулируют специфические мишени путем экспрессии в разное время и в различных тканях. Для проведения успешной микроРНК-терапии необходимо обеспечить доставку микроРНК или других молекул в специфический внутриклеточный компартмент, такой как эндоплазматический ретикулум или цитозоль. Важным и необходимым моментом является доставка микроРНК именно к гену-мишени, а не к какому-либо другому гену, не относящемуся к конкретному заболеванию. Так как многие мишени эффектов микроРНК еще не установлены, очень трудно, а порой и невозможно предсказать возможные эффекты со стороны не генов-мишеней.  

Сегодня в человеческом геноме обнаружено более 500 микроРНК, а с помощью компьютерного программирования предсказано, что человек может иметь более чем 1 000 микроРНК [19]. Предполагается, что более 30% генов, кодирующих белковые последовательности, у человека на посттрансляционном уровне регулируются, по крайней мере, одной микроРНК. В большинстве случаев несколько микроРНК могут регулировать один и тот же ген. Взаимоотношения таких микроРНК, их направление к одному гену, механизмы контроля остаются мало изученными. Все это еще предстоит выяснить в ближайшее время.

Список литературы находится в редакции

Поделиться с друзьями:

Книги

сборник - Гиперчувствительность к лекарственным препаратам. Руководство для врачей
сборник - Спадкові захворювання шкіри
сборник - Герпесвірусні нейроінфекції  людини
сборник - Атлас: герпесвірусні нейроінфекцїї
сборник - Дитяча дерматовенерологія
сборник - Иммунодефицитные болезни человека
сборник - Хвороби шкіри жінок у віковому аспекті
сборник - Клиника, диагностика и лечение герпетических инфекций человека: руководство для врачей
сборник - Клиническая иммунология и аллергология