Вплив рупатадину на дегрануляцію опасистих клітин людини, індуковану фактором активації тромбоцитів, у порівнянні з дезлоратадином і левоцетиризином

Фактор активації тромбоцитів (ФАТ) – це ліпідний медіатор, що виділяється багатьма клітинами, у тому числі опасистими клітинами (мастоцитами) й еозинофілами [1], причетними до таких алергічних захворювань (АЗ), як астма, алергічний риніт (АР) і анафілаксія [2-4]. Є докази, що ФАТ може активувати опасисті клітини легень людини (hLMC), але не опасисті клітини шкіри, через рецептори ФАТ і фосфоліпазу C-γ1 і -β2 [5]. Ці дані забезпечують вірогідний механізм, за допомогою якого ФАТ опосередковує ампліфікаційну петлю для активації опасистих клітин при формуванні алергічної відповіді.

Ключові слова: CV6209, дезлоратадин, LAD2, левоцетиризин, опасиста клітина (мастоцит), фактор активації тромбоцитів, рупатадин.

Роль ФАТ в астмі добре вивчена, і в кількох дослідженнях було продемонстровано, що ФАТ асоціюється з бронхоконстрикцією та гіперреактивністю бронхів [6, 7]. Крім того, ФАТ вважався найпотужнішим індуктором проникності судин серед медіаторів, які беруть участь у запаленні слизової оболонки носа, із ключовою роллю в разі ринореї та закладеності носа [3, 8-11]. Нарешті, рівні ФАТ та, що цікавіше, активність ФАТ-ацетилгідролази були пов’язані з тяжкістю анафілаксії [4, 12].

Експресію рецептора ФАТ описано щодо опасистих клітин людини. Рецептор ФАТ також був виявлений в hLMC, опасистих клітинах легень людини, але не в опасистих клітинах шкіри [5]. Дотепер не проводилися дослідження лінії опасистих клітин людини LAD2. Дегрануляція мастоцитів, індукована ФАТ, частково залежить від позаклітинного кальцію, що продемонстровано на опасистих клітинах периферичної крові людини [5] і лінії опасистих клітин людини HMC-1 при лейкозі [13].

Незважаючи на достовірну роль ФАТ у патофізіології АЗ, на сьогодні дослідження антагоністів ФАТ не виявили визначеного позитивного їх впливу на бронхіальну симптоматику [2, 14]. Крім того, немає досліджень із селективними антагоністами ФАТ при риніті або анафілаксії в людини. Відсутність доказів клінічної ефективності антагоністів ФАТ, імовірно, пояснює їх відсутність у нинішньому арсеналі засобів для лікування АЗ дихальних шляхів і обмежене їх використання в дослідженнях.

Рупатадин – це антагоніст Н1-рецепторів, призначений для лікування АР [15] і кропив’янки [16]. Він має властивості ідеального антигістамінного препарату (АГП) ІІ покоління, зокрема протиалергічні/протизапальні ефекти, такі як пригнічення секреції цитокінів [8, 17]. Крім того, антагоністичний вплив рупатадину на рецептор ФАТ був продемонстрований у дослідженнях in vitro та в широкій серії фармакологічних досліджень in vivo у тварин і людей [18].

Нещодавно invivo був продемонстрований клінічний анти-ФАТ ефект рупатадину за допомогою назального провокаційного тесту з ФАТ у людей [9, 10]. Однак механізм анти-ФАТ ефекту рупатадину на опасисті клітини людини остаточно не вивчений [17, 19].

Матеріали і методи

Речовини

PAF, дезлоратадин, WEB2086 і BN52021 було придбано в компанії Sigma-Aldrich. CV6209 – у Enzo Life Sciences. Рупатадин і левоцетиризин були надані компанією Grupo Uriach SA.

Культури опасистих клітин

Лінія опасистих клітин. Лінію опа­систих клітин людини LAD2, яку надали A. Kirshenbaum і DD Metcalfe (Національні інститути здоров’я), вирощували в середовищі без сироватки StemPro-34 (Invitrogen Life Technologies), доповненому живильною речовиною StemPro-34 і L-глутаміном (2 ммоль/л), пеніциліном (100 Од/мл), стрептоміцином (100 мг/мл) і 100 нг/мл рекомбінантного фактора стовбурових клітин (Preprotech) [10]. Культури зберігали за температури 37 °C у 5% CO2 у зволоженому інкубаторі.

Первинні hLMC. Під час планової операції були відібрані фрагменти здорової тканини легень, що було підтверджено гістологічним дослідженням. hLMC диспергували з подрібнених зразків легень за допомогою ферментативної процедури й очищали за допомогою методу спорідненості на основі магнітних кульок з антитілами до CD117 (MiltenyBiotec) [20]. Чистота мастоцитів, яку оцінювали за допомогою метахроматичного фарбування, перевищувала 98%. Клітини культивували в модифікованому сере­довищі Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (LifeTechnologies), доповненому 10% FBS, фактором рекомбінантних стовбурових клітин 100 нг/мл, інтерлейкіном-10 (IL-10; 1 нг/мл) і IL-6 (0,5 нг/мл) (Preprotech) протягом до 5 днів.

Дизайн дослідження

Через обмежену доступність hLMC більшість експериментів було проведено з LAD2. Для оцінки диференціального анти-ФАТ ефекту рупатадину не використовували дезлоратадин і левоцетиризин, оскільки жоден із них не продемонстрував анти-ФАТ ефекту. І навпаки, CV6209, WEB2086 і BN52021 є ФАТ-антагоністами з продемонстрованим інгібувальним ефектом [5, 21, 22].

Дегрануляцію опасистих клітин оцінювали за допомогою виявлення β-гексозамінідази і гістаміну в клітинах LAD2. По-перше, для встановлення оптимальної дози й часу інкубації визначали показники відповіді залежно від часу й дози. ФАТ оцінювали в разі використання дози 1 мкмоль/л протягом 15 і 30 хв і 10 мкмоль/л протягом 5, 15 і 30 хвилин. По-друге, мастоцити попередньо інкубували з АГП або анти-ФАТ впродовж 30 хв, а потім діяли на них ФАТ у концентрації 10 мкмоль/л протягом 30 хв (оптимальна доза і час інкубації) для дослідження дегрануляції. Досліджували рупатадин (1 мкмоль/л, 5 мкмоль/л і 10 мкмоль/л), дезлоратадин (1 мкмоль/л, 5 мкмоль/л і 10 мкмоль/л), левоцетиризин (1 мкмоль/л, 5 мкмоль/л і 10 мкмоль/л), CV6209 (0,2 мкмоль/л і 2 мкмоль/л), WEB2086 (1 мкмоль/л, 10 мкмоль/л і 100 мкмоль/л) і BN52021 (1 мкмоль/л, 10 мкмоль/л і 100 мкмоль/л). Для оцінки зв’язку між дегрануляцією опасистих клітин, індукованою ФАТ, і мобілізацією кальцію при визначенні кальцію в LAD-2 було оцінено кілька доз ФАТ (1 мкмоль/л, 10 мкмоль/л і 50 мкмоль/л).

Дегрануляцію мастоцитів оцінювали в hLMC тільки за допомогою визначення рівня гістаміну. Опасисті клітини попередньо інкубували з АГП або анти-ФАТ протягом 30 хв, а потім використанням діяли на них 10 мкмоль/л ФАТ упродовж 30 хв. Рупатадин, дезлоратадин і левоцетиризин досліджували в концентрації 10 мкмоль/л, оскільки це була єдина концентрація, яка пригнічувала вивільнення гістаміну, індуковане ФАТ, у LAD2. CV6209 досліджували в концентрації 2 мкмоль/л, і він був єдиним анти-ФАТ антагоністом, що використовували для цих експериментів через відсутність інгібувального ефекту BN52021 і WEB2086 у LAD-2 (дані не наведені).

Експресію рецептора ФАТ оцінювали в опасистих клітинах як із LAD2, так і з hLMC.

Результати дослідження

Витіснення трипанового синього в тесті на визначення життєздатності клітин. Тест на виключення барвника був використаний для визначення кількості життєздатних клітин після стимуляції ФАТ і антагоністами (левоцетиризином, рупатадином, дезлоратадином, CV6209, WEB2086 і BN52021) (усі використані в експериментах концентрації були перевірені). Методика заснована на принципі, згідно з яким живі клітини мають неу­шкоджені клітинні мембрани, що не допускають проникнення певних барвників, таких як трипановий синій, тоді як мертві клітини на це не здатні [23].

Аналіз вивільнення β-гексозамінідази. β-гексозамінідазу визначали в надосадовій рідині шляхом вивільнення 4-р-нітрофенолу з р-нітрофеніл N-ацетил-­бета-D-глюкозамініду (1,3 мг/мл) у ­цитратно-натрієвому буфері (рН 4,5). Реакцію припиняли шляхом додавання карбонатно-натрієвого буфера 0,2 М (рН 10,7). Вивільнення 4-P-нітрофенолу кількісно визначали за допомогою поглинання при 405 нм. Відсоток вивільнення β-гексозамінідази обчислювали так: швидкість вивільнення β-гексозамінідази (%) = [вивільнення зразка – спонтанне вивільнення / максимальне вивільнення – спонтанне вивільнення] × 100.

Мобілізація кальцію. Після мобілізації кальцію в клітинах LAD2 був проведений флюорометричний аналіз для визначення вільного кальцію за допомогою флуоресцентного барвника фтор-4-AM (Molecular Probes, Invitrogen). Загалом 0,2×106 комірок/точку завантажували з 5 мМ фтор-4-АМ протягом 30 хв за температури 4 °C у темряві, двічі промивали буфером Тіроде і ресуспендували. Флуорометричні вимірювання проводили в ModulusII Microplate Multimode Reader (Turner BioSystems) відповідно до інструкцій виробника.

Ферментний імуносорбентний аналіз (ELISA) гістаміну. Дегрануляцію опасистих клітин також контролювали шляхом визначення кількості гістаміну, що виділяється в позаклітинну рідину. ­Комерційний набір ELISA (Immunotech, Beckman Coulter Co) використовували згідно з інструкцією виробника. Нетто-­відсоток вивільнення гістаміну обчислювали зі співвідношення кожного зразка, при цьому кількість спонтанно вивільненого гістаміну віднімали від загальної його кількості.

Експресія рецептора PAF за допомогою Вестерн-блоттингу. Загальні лізати опа­систих клітин у кількості 1×106 для LAD2 і 0,5×106 для hLMC розділяли за допомогою SDS-PAGE (10%) і переносили на мембрани з полівінілідендифториду (Millipore). Блот досліджували з використанням антитіла проти рецептора ФАТ (Vitro). Мембрани, на які переносили досліджуваний матеріал, візуалізували за допомогою розширеного набору для хемілюмінесценції (Santa Cruz Biotechnology).

Статистичний аналіз

Дані відображені як середнє значення (SD). Групи порівнювали за допомогою непараметричного тесту (Манна–Уїтні з корекцією Холма–Бонферроні). Значення р корегували залежно від кількості порівнянь (k). Тому значення р<0,05/k вважали статистично достовірним.

Результати

Токсичність ФАТ і антагоністів

Лише рупатадин і дезлоратадин у дозі 100 мкмоль/л призводили до помірного збільшення загибелі опасистих клітин порівняно з розчинником (DMSO 1%) (дані не наведені).

Експресія рецептора ФАТ

Експресія рецептора ФАТ (смуга 48 кДа) була вперше описана в LAD2 і підтверджена в hLMC [5] (рис. 1, А).

Показники відповіді, залежно від часу й дози ФАТ, при активації LAD2

ФАТ індукував активацію клітин LAD2, що залежала від дози і часу впливу. Хоча ФАТ достовірно призводив до вивільнення β-гексозамінідази в концентрації 1 мкмоль/л і 10 мкмоль/л як на 15-й, так і на 30-й хвилинах, ми вибрали концентрацію (10 мкмоль/л) і час (30 хв), асоційовані з максимальною дегрануляцією мастоцитів (33,5%), як позитивний експериментальний контроль (рис. 1, В).

ФАТ-індукована мобілізація кальцію в LAD2

Спостерігали дозозалежну (10-50 мкмоль/л) відповідь на ФАТ. Відмінності між 50 мкмоль/л і 10 мкмоль/л не були статистично достовірними. Ні ФАТ у кількості 1 мкмоль/л, ні негативний контроль не спричинювали інфлюкс кальцію (рис. 1, С).

Рис. 1. Експресія рецептора ФАТ за допомогою Вестерн-блотингу в опасистих клітинах LAD2 (смуга 1) і тканини легень людини (n

Вплив антагоністів ФАТ на ФАТ-індуковану дегрануляцію опасистих клітин

У LAD2 CV6209 інгібував ФАТ-індуковане вивільнення β-гексозамінідази в дозі 0,2 мкмоль/л (45%; р<0,01) і 2 мкмоль/л (56%; р<0,001) (рис. 2, А) і вивільнення гістаміну в дозі 2 мкмоль/л (30%; р<0,01) (рис. 2, B). WEB2086 і BN52021 не пригнічували ФАТ-індуковану дегрануляцію мастоцитів у LAD2 або у hLMC (дані не наведені).

У hLMCs CV6209 у дозі 2 мкмоль/л інгібував ФАТ-індуковане вивільнення гістаміну (24%; р<0,01) (рис. 2, С).

Рис. 2. Вплив специфічного анти-ФАТ антагоніста рецептора (CV6209) на вивільнення ФАТ-індукованого медіатора з опасистих клітин.

Вплив рупатадину, левоцетиризину і дезлоратадину на ФАТ-індуковану дегрануляцію опасистих клітин

Вивільнення β-гексозамінідази відбувається в LAD2. Лише рупатадин у дозі 10 мкмоль/л (48%) достовірно (р<0,01) інгібував вивільнення β-гексозамінідази, індуковане ФАТ. Не виявлено статистично достовірних відмінностей у разі використання рупатадину в дозі 5 мкмоль/л (30%), 25 мкмоль/л (34%) або 100 мкмоль/л (без інгібування) або левоцетиризину в дозі від 1 мкмоль/л до 100 мкмоль/л (рис. 3, А та 3, В відповідно). У випробуваних концентраціях дезлоратадин не виявляв інгібувального ефекту (рис. 3, С).

Рис. 3. Вплив АГП ІІ покоління на ФАТ-індуковане вивільнення β-гексозамінідази в клітинній лінії LAD2.

Вивільнення гістаміну в LAD2. Рупатадин у дозі 5 мкмоль/л (29%) і 10 мкмоль/л (30%) і левоцетиризин у дозі 5 мкмоль/л (25%), 10 мкмоль/л (27%) і 25 мкмоль/л (25%) достовірно інгібували вивільнення гістаміну, індуковане ФАТ (р<0,01) (рис. 4, A і B). Дезлоратадин у жодній із досліджуваних концентрацій достовірно не пригнічував вивільнення гістаміну (рис. 4, С).

Рис. 4. Вплив АГП ІІ покоління на ФАТ-індуковане вивільнення гістаміну в клітинній лінії LAD2.

Вивільнення гістаміну в hLMC. Рупатадин у дозі 10 мкмоль/л (12%) достовірно (р<0,01) інгібував вивільнення гістаміну, індуковане ФАТ, але цей ефект не спостерігався при застосуванні ні дезлоратадину (2%), ні левоцетиризину (4%) (рис. 5).

Рис. 5. Вплив АГП ІІ покоління на ФАТ-індуковане вивільнення гістаміну в первинних опасистих клітинах легень людини

Обговорення

LAD2 є однією з трьох добре вивчених ліній опасистих клітин людини і зазвичай служить заміною опасистим клітинам у зрілій тканині [24]. Експресія рецептора ФАТ була продемонстрована в кількох типах клітин, у тому числі в тромбоцитах, еозинофілах і hLMC [25-27], але ніколи не вивчалася в LAD2. У нашому дослідженні ми вперше показали наявність рецептора ФАТ у LAD2. Ми також підтвердили, що рецептор ФАТ експресується в hLMC [5].

У дослідженні MASPAF ми продемонстрували, що рупатадин і, меншою мірою, левоцетиризин інгібують дегрануляцію мастоцитів людини, індуковану ФАТ, і припустили, що цей ефект можна опосередкувати через рецептор ФАТ. Дезлоратадин, антигістамінний засіб без анти-ФАТ ефекту, не продемонстрував інгібувального ефекту.

На додаток до дегрануляції мастоцитів наше дослідження також підтвердило здатність ФАТ мобілізувати внутрішньоклітинний кальцій, що раніше показали інші автори [5, 13]. Ці дані та інгібувальний ефект, продемонстрований специфічними антагоністами ФАТ, такими як CV6209, свідчать про те, що ефект ФАТ у нашій моделі може бути опосередкований активацією рецептора ФАТ.

Kajiwara та співавт. [5] нещодавно показали активацію опасистих клітин людини через рецептор ФАТ, досягаючи 20-30% загального вивільнення гістаміну в hLMC за концентрації лише 1 нмоль/л [5]. Концентрація, використана в нашому дослідженні, була вищою (10 мкмоль/л), ніж у дослідженні Kajiwara та співавт., імовірно, через відмінності в типах клітин, що їх було використано (LAD2 і hLMC проти опасистих клітин із похідних із периферичної крові), і високу міжіндивідуальну чутливість у відповідь на стимуляцію ФАТ, що спостерігається у hLMC. Наші результати відрізняються від результатів, отриманих Alevizos та співавт. [19], які використовували LAD2, стимульований ФАТ. Незважаючи на те що вивільнення гістаміну було індуковано ФАТ у низькій концентрації (0,01 мкмоль), така концентрація не могла спричинити вивільнення β-гексозамінідази. У нашому дослідженні ФАТ у концентрації 10 мкмоль/л індукував вивільнення гістаміну і β-гексозамінідази без впливу на життєздатність клітин. Ба більше, нам не вдалося продемонструвати мобілізацію кальцію за концентрації ФАТ нижче 10 мкмоль/л, що свідчить про те, що нижчі концентрації ФАТ не активують рецептор ФАТ у LAD2.

У нашому дослідженні CV6209 інгібував ФАТ-індукований викид гістаміну і β-гексозамінідази як у LAD2, так і в hLMC. Однак антагоністи ФАТ BN52021 і WEB2086 не виявляли інгібувального ефекту (дані не наведені). Хоча кілька досліджень порівнювали рупатадин із WEB2086 і BN52021 і продемонстрували більший вплив цих антагоністів ФАТ на смертність, спричинену ФАТ, у мишей або агрегацію тромбоцитів у кролів і на зразках крові людини [18], їхній вплив на опасисті клітини ніколи не вивчався. З іншого боку, було показано, що CV6209 пригнічує ФАТ-індукований викид гістаміну мастоцитами периферичної крові людини, хоча його ніколи не порівнювали з рупатадином [5]. Наші результати показали, що інгібувальний ефект рупатадину був порівнянний з таким CV6209 на LAD2, хоча вплив CV6209 на hLMC був більшим, ніж у рупатадину.

У цьому дослідженні ми продемонстрували, що рупатадин послідовно інгібує ФАТ-індуковану дегрануляцію, блокуючи вивільнення гістаміну і β-гексозамінідази як у LAD2, так і в hLMC.

В одному з небагатьох досліджень, де вивчали роль рупатадину в опасистих клітинах, Alevizos та співавт. [19] порівнювали вплив рупатадину і димедролу на ФАТ-індуковане вивільнення гістаміну та цитокінів у LAD2. Розбіжності в ефекті рупатадину, що спостерігаються в нашому дослідженні, та в роботі Alevizos та спів­авт., можуть бути пов’язані з відмінностями у використаних концентраціях ФАТ. Ми використовували достовірно більшу дозу ФАТ (10 мкмоль/л) як тригер дегрануляції та виявили, що рупатадин здатний пригнічувати ФАТ-індуковану дегрануляцію в діапазоні від 1 до 10 мкмоль/л. Дивно, але, незважаючи на використання в 10 разів нижчої концентрації ФАТ, Alevizos та співавт. показали, що лише рупатадин у дозі 25 мкмоль мав достовірний інгібувальний ефект. Крім того, обидва антагоністи рецепторів Н1 – димедрол у дослідженні Alvezios та співавт. і дезлоратадин у нашому дослідженні – не чинили інгібувального впливу на ФАТ-індуковану продукцію гістаміну або цитокінів, що свідчить про відсутність анти-ФАТ-ефекту. Інші попередні дослідження, проведені з рупатадином на опасистих клітинах людини, зокрема на мастоцитах пуповинної крові, показали, що рупатадин у концентрації 25 мкмоль/л інгібує IgE-опосередковане вивільнення фактора некрозу пухлини-альфа (TNF-альфа) і цитокінів (IL-6, IL-8, IL-10 та IL-13) [17]. У HMC-1 і LAD2 рупатадин у концентрації від 10 до 50 мкмоль/л інгібував вивільнення цитокінів, індуковане речовиною Р, без впливу на життєздатність клітин у будь-якій концентрації [17].

Також у цьому дослідженні було встановлено, що дезлоратадин не чинить інгібувального ефекту і що левоцетиризин пригнічує ФАТ-індуковану дегрануляцію LAD2 у деяких концентраціях, але не пригнічує дегрануляцію в hLMC. Однак Weller та співавт. [28] показали, що дезлоратадин у концентрації 1 мкмоль/л здатний інгібувати вивільнення гістаміну в ізольованих опасистих клітинах шкіри людини. Queralt та співавт. [29] повідомили про подібний ефект у лоратадину і рупатадину щодо мастоцитів собак і HMC-1 після стимуляції іонофором кальцію A23187, ConA та анти-IgE. Однак у нашому дослідженні дезлоратадин, метаболіт лоратадину, не виявляв інгібувального ефекту під час стимуляції ФАТ у LAD2 і hLMC. Цю невідповідність можна пояснити різним фенотипом опасистих клітин у шкірі і легенях людини [30, 31], а також різними тригерами, що використовуються (анти-IgE, іонофор кальцію, Con A та речовина P) [28, 32]. Хоча було показано, що дезлоратадин, АГП ІІ покоління, має деякі протиалергічні ефекти [33] і вдесятеро сильніший за лоратадин в антагонізмі гістамін-індукованого збільшення проникності мікросудин слизової оболонки носа [34], у нашому дослідженні встановлено, що він не має анти-ФАТ-ефекту.

Наскільки нам відомо, жодні дослідження не вивчали вплив левоцетиризину на опасисті клітини. Повідомлялося про деякі протиалергічні ефекти левоцетирезину як АГП [35], хоча жоден із них не пов’язаний із ФАТ. Проте, хоча меншою мірою, ніж рупатадин, левоцетиризин інгібував ФАТ-опосередковану дегрануляцію LAD2 (переважно вивільнення гістаміну в кількох концентраціях), що також свідчить про потенційну анти-ФАТ-активність у LAD2, але не в первинних hLMC.

Зауважимо, що концентрація АГП, необхідна для зменшення активації мастоцитів invitro, у нашому дослідженні була вища за необхідну. Одноклітинні моделі є частково репрезентативними стосовно того, що відбувається в організмі людини, а роль метаболічних шляхів, що реалізуються в моделі invivo, ігнорується в дослідженнях invitro (на основі клітин). Крім того, середовище культури клітин не відтворюється точно в умовах invivo. Тому наше дослідження потрібно розглядати як модель invitro для дослідження впливу препарату на активацію опасистих клітин / вивільнення медіатора, хоча використовувані концентрації не є корисними для визначення терапевтичних доз (завжди є обов’язковим пошук дози invivo).

Нарешті, найсильніший інгібувальний ефект рупатадину при ФАТ-індукованій дегрануляції опасистих клітин, як з LAD2, так і з hLMC, чітко корелює з його клінічним ефектом при АР [10], де рупатадин, але не левоцетиризин, виявляв інгібувальний ефект (зменшення загальної оцінки назальних симптомів).

Висновки

Ми продемонстрували, що рупатадин і (хоча й меншою мірою) левоцетиризин проявляють анти-ФАТ активність щодо опасистих клітин людини. Подвійна антигістамінна й анти-ФАТ активність рупатадину може забезпечити створення лікарських препаратів із більшою протизапальною/протиалергічною активністю, як повідомлялося в інших публікаціях [10].

Список літератури – у редакції.

Munoz-Cano R. et al. Effects of Rupatadine on Platelet-Activating Factor-Induced Human Mast Cell Degranulation Compared With Desloratadine and Levocetirizine (The MASPAF Study). J Investig Allergol Clin Immunol, 2017; Vol. 27(3): 161-168. doi: 10.18176/jiaci.0117