скрыть меню

Спектр антигенных мишеней антинуклеарных антител при определенных клинических фенотипах аутоиммунной миастении и склеродермии

страницы: 35-42

Е.М. Климова, д-р биол. наук, профессор, зав. лабораторией, Л.А. Дроздова, канд. биол. наук, ст. науч. сотр., диагностическая лаборатория с иммуноферментным и иммунофлюоресцентным анализом, ГУ «Институт общей и неотложной хирургии им. В.Т. Зайцева НАМН Украины», г. Харьков

На сегодняшний день благодаря достижениям современной иммунологии стало возможным понимание механизмов развития заболеваний, в основе которых лежит аутоагрессия иммунной системы по отношению к тем или иным структурам собственного организма [4]. Аутоантитела (ААТ) являются серологическим признаком большинства аутоиммунных заболеваний [8]. В отличие от генетических маркеров, которые указывают на предрасположенность к развитию заболевания, некоторые ААТ служат диагностическими биомаркерами и критериями классификации для ряда патологических состояний. В качестве аутоантигенов могут выступать белки, фосфолипиды, полисахара, нуклеиновые кислоты. В настоящее время описаны около 200 разновидностей антител к ядерным компонентам – нуклеопротеинам и рибонуклеиновым кислотам, которые получили название антинуклеарные антитела (antinuclear antibody – ANA) [6].

АNA представляют собой особую группу ААТ, которые при определенных условиях начинают синтезироваться к белковым молекулам, являющимся составной частью основных компонентов клеточного ядра, и всегда проявляют патогенные свойства. При аутоиммунных заболеваниях ААТ к ядерным антигенам не оказывают прямое цитотоксическое действие на клетки человека, однако образующиеся иммунные комплексы (антиген + антитело + комплемент) способны запускать иммунологическое воспаление, особенно в местах, где сосуды особенно тонкие, в том числе в почках, коже, центральной нервной системе, синовиальной оболочке суставов, плевре и т.п. [6].

Патогенетическое значение ANA состоит в их способности формировать циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), которые откладываются в структурах различных органов, инициируют освобождение лизосомальных ферментов с развитием иммунного воспаления, ведущего к деструкции тканей. Продукты этой деструкции являются новыми антигенами, к которым образуются новые антитела. Весь этот процесс вновь повторяется в виде замкнутого круга, обеспечивая хронический характер заболевания [3]. Различный спектр ААТ выявляют при таких заболеваниях, как миастения и склеродермия. Эти аутоиммунные заболевания относят к системным аутоиммунным заболеваниям, частота возникновения которых неуклонно растет.

Миастения – заболевание, характеризующееся патологической мышечной слабостью и повышенной утомляемостью различных мышечных групп с прогрессирующим течением. Одной из основных причин возникновения миастении является антителоопосредованное нарушение нейро-мышечной передачи импульсов в синапсах из-за блокирования антителами различных субъединиц никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) или из-за их деструкции клонами аутоагрессивных Т-лимфоцитов. При некоторых клинических фенотипах миастении помимо нарушения синаптической передачи развиваются структурно-функциональные изменения тимуса.

Предикторами развития миастении могут выступать микроорганизмы и вирусы, вызывающие воспалительные реакции, или стресс, сопровождающийся нарушением экспрессии кластеров дифференцировки иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих центральные и периферические механизмы формирования аутотолерантности. Важная роль в сдерживании аутоиммунной агрессии принадлежит костимулирующим молекулам CD28+ и CD25+ Т-регуляторных лимфоцитов, продуцентам противовоспалительного интерлейкина-10 (ИЛ-10) [14, 15].

Склеродермия также является сложной полипатией, причины и механизы ее формирования до сих пор не ясны. Системные изменения при данном заболевании свидетельствуют о важной роли аутоиммунного компонента, природа которого может быть различной [12]. Сегодня склеродермию относят к васкулитам, которые характеризуются увеличением продукции фиброзного внеклеточного матрикса, утолщением кожи, синдромом Рейно, сужением периферических сосудов. В системный склероз вовлечены внутренние органы, такие как легкие, почки [12].

Склеродермия отличается от других заболеваний соединительной ткани отсутствием выраженного воспалительного процесса, основным патогенетическим звеном этого заболевания явлется деструкция внеклеточного матрикса. Интересным является тот факт, что при склеродермии, так же как и при миастении, выявляют антитела к АХР, вследствие чего происходит вазоконстрикция и уплотнение кожных покровов, развивается легочная и почечная гипертензия, ишемия желудочно-кишечного тракта. Другие авторы при склеродермии выявили антитела к поверхностным ингибирующим рецепторам В-лимфоцитов – CD22+ и к рецепторам СD25+ Т-регуляторных лимфоцитов, вследствие чего ограничивается контроль продукции ААТ [10].

Имеющиеся данные позволяют высказать предположение о значимой роли ANA при разных аутоимунных патологиях, в частности миастении и склеродермии. В связи с этим важным является поиск новых молекулярных мишеней аутоиммунной агрессии при различных механизмах утраты аутотолерантности.

Целью настоящей работы было исследование наличия антител к α1- и α7-субъединицам нАХР, репертуара и частоты встречаемости ANA при различных клинических фенотипах миастении и склеродермии для понимания механизмов патогенеза различных форм данных заболеваний.

Материалы и методы исследования

вверх

Был обследован 21 пациент с различными клиническими фенотипами миастении – тимус-независимой миастенией (М), тимус-зависимой миастенией на фоне гиперплазии тимуса (МГ) и на фоне местно-распространенной тимомы (МТ) – в возрасте от 14 до 72 лет и 22 пациента со склеродермией в возрасте от 19 до 78 лет, из них 3 пациента с системной склеродермией и 19 пациентов – с локальной.

Для определения наличия антител к α1- и α7-субъединицам нАХР в сыворотке крови использовали тест-систему для иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе. В основе метода лежит специфическое взаимодействие антигена, сорбированного на планшетах, с ААТ к α1- и α7-субъединицам нАХР, содержащимися в исследуемых сыворотках. Образовавшийся комплекс «антиген–антитело» выявляли с помощью конъюгата, пероксидаза которого катализирует расщепление субстрата (перекиси водорода), вызывая изменение окраски индикатора. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна содержанию антител к α1- и α7-субъединицам нАХР. Измерение оптической плотности проводили при длине волны 450 нм на иммуноферментном анализаторе STAT FAX 3200 (США).

Для выявления сывороточных ANA использовали скрининговый мультиспецифический тест, выполняемый методом непрямого ИФА. Разведенную сыворотку пациентов инкубировали в лунках планшета с нанесенной смесью очищенных антигенов ядерных молекулярных структур SS-A(52 кДа), SS-A(60 кДа), SS-В, RNP-70, Sm, RNP/Sm, Scl-70, Centromere B и Jo-1. Связавшиеся с антигеном антитела (ANA) сыворотки пациентов идентифицировали с помощью ферментного конъюгата, содержащего антитела против человеческого IgG. Далее в лунку добавляли субстратно-хромогенный реагент, который превращается в окрашенный продукт под влиянием ферментного компонента конъюгата. Для количественной оценки содержания ANA в сыворотке крови пациентов использовали формулу с учетом калибратора, содержащего количество cуммарных ANA, соответствующих норме:

 

В норме отрицательный индекс <1,0, положительный индекс >1,2. В исследованиях использовали набор реактивов ANAscreen ORGENTEC, Германия.

При получении у пациентов положительного результата скринингового обследования с помощью ИФА на втором этапе для выявления молекулярной мишени сывороточных специфических ANA применяли непрямой иммунофлуоресцентный метод с использованием моноклональных антител (МКАТ), меченных FITC (Набор реактивов EUROIMMUN, Германия).

Образцы сыворотки крови пациентов разводили 1:100 буфером ФСБ-Т и тщательно перемешивали (на вортексе – 4 с). В две лунки стекол с использованием в качестве субстрата криостатных срезов печени приматов и клеток линии HЕp-2 (эпителиальные клетки рака гортани человека) наносили по 25 мкл положительного и отрицательного контроля. В другие лунки вносили по 25 мкл разведенного образца сыворотки.

Исследуемые образцы, нанесенные на субстрат НЕр-2 и печени в ячейках стекла, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре (от +18 0С до +25 0С). Через 30 мин промывали стекла струей ФСБ-Т буфером (рН = 7,2) из стерильной колбы. Стекло с промытыми лунками помещали вертикально в стерильный стакан, содержащий ФСБ-Т, и промывали в течение 5 мин, помешивая. Наносили в каждую реакционную зону (ячейку) по 20 мкл меченных флуоресцеином антител к глобулинам человека (конъюгат). Инкубировали стекла 30 мин при комнатной температуре (от +18 0С до +25 0С). Через 30 мин промывали стекла струей ФСБ-Т буфера (рН = 7,2) из стерильной колбы. Стекло с промытыми лунками помещали вертикально в стерильный стакан, содержащий ФСБ-Т, и промывали в течение 5 мин, помешивая.

Наносили среду для заливки по 10 мкл на каждую ячейку и накрывали покровным стеклом. Учет результатов проводили с помощью микроскопа, учитывая тип свечения. Для срезов органов использовали увеличение 20x10, для клеточных субстратов – 40x10. Использовали кубик фильтров: фильтр возбуждения – 488 нм, цветоделительный фильтр – 510 нм, блокирующий фильтр – 520 нм.

Результаты и их обсуждение

вверх

Исследование основных патогенетических маркеров миастении – ААТ к нАХР концевой пластинки синапса с помощью ИФА позволило выявить закономерность в наличии определенного репертуара антител при клинических фенотипах тимус-независимой (М) и тимус-зависимой (МГ и МТ) миастении. Так как нАХР состоят из нескольких субъединиц, присоединяющих ацетилхолин, то мишенью аутоиммунных реакций может быть любая из них. Аутоантитела к α1-субъединице нАХР выявили у всех обследованных больных с тимус-зависимой и тимус-независимой миастенией, максимальный титр – у пациентов группы М. У больных с МТ выявили наличие ААТ к другой мишени – α7-субъединице нАХР.

Скрининговые исследования наличия антител к другим мишеням с помощью ИФА позволили выявить наличие ANA у больных с тимус-зависимой миастенией на фоне местно-распространенных тимом (МТ), содержание которых в 4 раза превышало контрольный уровень (и в среднем составляло (4,2 ± 0,2) ед.). При других клинических фенотипах тимус-независимой (М) и тимус-зависимой (МГ) миастении ANA в сыворотке крови выявлены не были (табл. 1).

Таблица 1. Количественное содержание и частота встречаемости ANA у пациентов с различными клиническими формами миастении

Иммунологический показатель

Референтные значения

Фенотип миастении, n=21

М

МГ

МТ

n=10

n=2

n=9

ИФА-скрининг

Наличие ANA

1,0 ± 0,1

0,3 ± 0,02

0,6 ± 0,01

4,2 ± 0,2

Частота встречаемости ANA в обследуемых выборках пациентов, %

0

0

88,8

 

Аутоиммунные реакции были более выражены и многообразны у больных на фоне местно-распространенных тимом и затрагивали большее количество различных мишеней: ААТ были выявлены к α1- и α7-субъединицам нАХР, к ядерным структурам.

Для визуализации специфичности ANA проводили иммунофлуоресцентный анализ (РИФ), позволивший определить целый ряд дополнительных мишеней для ААТ в виде различных компонентов клеточных ядер у пациентов с МТ.

Рис. 1. ANA к центромерам хромосом у пациентов с тимомой на фоне миастении (МТ) (РИФ-исследование: окраска флуоресцентным красителем FITC стандартных антигенных субстратов HЕp-2 после взаимодействия c сывороточными антителами)

У молодых пациентов (до 35 лет) с миастенией на фоне тимом были выявлены ANA к центромерам хромосом (табл. 2), которые ответственны за направленное движение хромосом во время митоза, участвуют в адгезии сестринских хроматид, образовании кинетохора, спаривании гомологичных хромосом, а также вовлечены в контроль генетической экспрессии. Иммунофлуоресцентный метод позволил определить свечение, которое характеризует центромерный тип связывания антител в виде дискретных крупнозернистых пятен: гранулы небольшого и одинакового размера (46 или 92 центромер на ядро в хромосомах и хроматидах). В интерфазных клетках эти гранулы равномерно распределены в ядре (рис. 1, а), тогда как в митотических клетках они образуют лентовидную структуру – одну посредине ядра (на стадии метафазы; рис. 1, б) или две параллельные (на стадии анафазы; рис. 1, в).

Таблица 2. Специфичность ANA у пациентов с различными клиническими формами миастении

Иммунологический показатель

Фенотип миастении, n=21

М

МГ

МТ

n=10

n=2

n=9

РИФ

Наличие ANA к различным молекулярным мишеням клеточного ядра

ANA не обнаружены (–)

ANA не обнаружены (–)

ANA к CEMP A, B, C (центромерам хромосом); n=4 (44,4% от всей популяционной выборки МТ)

ANA к центро-мерному белку F; n=3 (33,4% от всей популяционной выборки МТ)

ANA к белку ахроматинового веретена NuMa; n=1 (11,1% от всей популяционной выборки МТ)

ANA к белкам цитоскелета (цитокератины, тропо-миозин); n=1 (11,1% от всей популяционной выборки МТ)

 

Также у пациентов группы МТ были выявлены ANA к центромерному белку F (CTNPF; см. таблицу 2), о чем свидетельствует картина связывания сывороточных антител пациента со стандартным антигенным субстратом HЕp-2: ядерный пестрый рисунок с выраженной изменчивостью интенсивности, с самым сильным окрашиванием в фазе G2 и слабым, а также отрицательным окрашиванием в фазе G1 клеточного цикла. ААТ к белку F центромер положительны только в прометафазе и метафазе и видны на препарате в виде нескольких мелких и слабых точек одинакового размера.

Рис. 2. ANA к центромерному белку F (CTNPF) у больных с тимомой (РИФ-исследование: окраска флуоресцентным красителем FITC комплекса сывороточных антител со стандартным антигенным субстратом HЕp-2 после их взаимодействия)

Прометафазные клетки имеют слабое окрашивание ядерной оболочки. Во время анафазы и телофазы наблюдается интенсивное окрашивание в средней зоне, где происходит разделение дочерних клеток. Цитоплазма митотических клеток диффузно окрашена (рис. 2). По данным M. J. Fritzler, наличие ANA к центромерному белку F является маркером малигнизации [13], что наблюдается у больных с опухолевым перерождением тимуса.

У пациентов группы МТ также был выявлен еще один вид ANA – к белку NuMa, который ассоциирован с центросомой и принимает участие в образовании митотического веретена (см. таблицу 2). В интерфазных клетках он распределен в ядре, а в митотических – в полюсах веретена, и накопление этого белка в микротрубочках веретена способствует стабилизации ориентации их пучков [1].

Рис. 3. ANA к белку ахроматинового веретена NuMa у больных с тимомой на фоне миастении (РИФ-исследование: окраска флуоресцентным красителем FITC комплекса сывороточных антител со стандартным антигенным субстратом HЕp-2 после их взаимодействия)

Применение специфического антигена HЕp-2 для выявления данного антигена при флуоресцентной микроскопии позволило выявить мелкое пятнистое окрашивание ядер на разных стадиях клеточного цикла межфазных клеток, при этом окрашивание ядрышек отсутствует (рис. 3, а), а митотические клетки проявляют яркую флуоресценцию волокон ахроматинового веретена (рис. 3, б).

Показано, что антитела к белку ахроматинового веретена NuMa встречаются редко, в основном при синдроме Шагрена и системной красной волчанке [18]. Но нами выявлены антитела NuMa у обследованных пациентов с миастенией на фоне тимомы, что свидетельствует о сходных механизмах аутоиммунизации.

Рис. 4. ANA к белкам цитоскелета у пациентов с тимомой на фоне миастении (РИФ-исследование: окраска флуоресцентным красителем FITC комплекса сывороточных антител со стандартным антигенным субстратом HЕp-2 после их взаимодействия)

Также у пациентов с миастенией на фоне тимомы были выявлены и другие ANA к цитоскелету, представленному белками цитокератинами и тропомиозином. Известно, что цитокератины входят в состав промежуточных филаментов цитоскелета клеток, а тропомиозин представляет собой волокнистый белок, взаимодействующий с актином в мышечной ткани и участвующий в процессе сокращения мышц. На препарате связывания белков цитоскелета с ANA сыворотки пациентов выявлен светящийся цитоплазматический фибриллярный нитчатый паттерн, который представляет собой ярко окрашенные микротрубочки и промежуточные волокна, распространяющиеся в направлении от ядерной оболочки и окрашенные более интенсивно в участках, прилежащих к ядру (рис. 4, а). В митотических клетках белки цитоскелета, связанные с ANA, визуализируются в виде многочисленных ярких точек, расположенных вокруг несветящихся хромосом (рис. 4, б).

Таким образом, ИФА спектра ААТ у больных с различными клиническими фенотипами миастении выявил у всех обследованных наличие ААТ к α1-субъединице нАХР, а скрининговый ИФА-метод и РИФ позволил выявить ANA только у больных с тимус-зависимой миастенией на фоне тимомы.

В другой группе пациентов, у которых была диагностирована системная или локальная формы склеродермии, проведение скринингового исследования ANA позволило выявить наличие этих антител у 10 пациентов из 22 обследованных: у 1 пациента с системной формой заболевания и у 9 пациентов с локальной формой.

Рис. 5. ANA к рибонуклеопротеину U1-nRNP, который участвует в инициации сплайсинга пре-мРНК (РИФ: окраска флуоресцентным красителем FITC комплекса сывороточных антител со стандартным антигенным субстратом HЕp-2 после их взаимодействия)

Визуальное исследование с помощью непрямого метода иммунофлуоресценции с применением антител, меченных флуоресцентным красителем FITC, позволило определить специфичность ANA у пациентов, у которых выявили суммарные ААТ к ядерным структурам. Были выявлены ANA к рибонуклеопротеинам – U1-nRNP, Sm; аппарату Гольджи, а также белкам SS-A/Ro, SS-B/La и Ku. Антитела к рибонуклеопротеинам U1-nRNP выявлены у 6 пациентов молодого возраста – от 19 до 45 лет (средний возраст 34,3 года), в стадии обострения и давностью заболевания до 3 лет (рис. 5, табл. 3). Важным является рассмотрение патогенетической роли ANA к специфическим мишеням ядерных структур, которые обеспечивают те или иные клеточные функции на различных стадиях клеточного цикла.

Таблица 3. Количественное содержание ANA и характер их связывания с ядерными структурами

Иммунологический показатель

Системная,

n=3

Формы склеродермии,

(n = 22)

Локальная, n=19

ИФА – скрининг

Наличие ANA

1,7 ± 0,1

n=1

1,3± 0,04

n=9

Частота встречаемости ANA в обследуемой выборке пациентов, %

33,3

47,4

Визуальное РИФ-исследование

Специфичность

ANA к различным молекулярным мишеням клеточного ядра

 

ANA к комплексу PM/Scl (экзосоме);

n=1

ANA к сплайсосоме U1-nRNP с RNP-антигенами (осуществляют сплайсинг мРНК); n=6

ANA к SS-A (Ro) – ядерному RNP, ANA к SS-B/La связанному с РНК-полимеразой 3, ANA к Ku-гетеродимерному ДНК-связывающему белку; n=2

ANA к компонентам аппарата Гольджи; n=1

 

Иммунофлуоресцентная микроскопия на клетках Hep-2 в стадии профазы и интерфазы выявила взаимодействие сывороточных антител пациентов с антигенами структур ядра U1-nRNP – крупногранулярное свечение всего ядра, за исключением ядрышек. В митотических клетках хромосомы остаются темными, а периферия равномерно окрашена (паттерн АС-5; см. рисунок 5).

У 2 пациентов старшей группы в возрасте от 63 до 69 лет (средний возраст 66 лет) с давностью заболевания более 10 лет на стадии обострения выявили другой тип ANA к белкам нуклеоплазмы: SS-A/Ro, SS-B/La, Ku (см. таблицу 3). SS-A/Ro представляет собой белок, связанный с РНК Y1-Y5 в составе сплайсосомы. Антиген SS-B/La – нуклеоплазматический комплекс фосфопротеина (48 kDa) с Ro РНК (hY1-hY5), являющийся терминальным транскрипционным фактором для РНК-полимеразы III. Белок Ku представляет собой гетеродимерный ДНК-связывающий белок, образованный субъединицами p70 и p80. Гетеродимер Ku обеспечивает ДНК-связывающие и регуляторные функции ДНК-зависимой протеинкиназы, которая является центральным ферментом для рекомбинации ДНК в эукариотических клетках. Белок Ku играет важную роль в многочисленных ядерных процессах, включая восстановление ДНК, V(D)J-рекомбинацию, поддержание теломер и регулирование специфической транскрипции генов. Известно, что антитела к Ku выявляются у 20% пациентов с перекрестным синдромом склеродермия–полимиозит.

В клетках HЕp-2 на стадии профазы и интерфазы выявили взаимодействие сывороточных антител пациентов с антигенными структурами ядер (SS-A/Ro, SS-B/La, Ku) в виде однородной и регулярной флуоресценции по всей нуклеоплазме, ядрышки не были окрашены; митотические клетки (метафаза, анафаза и телофаза) имеют интенсивно однородно окрашенную массу хроматина (паттерн АС-4; рис. 6).

Рис. 6. ANA к белкам нуклеоплазмы SS-A/Ro, SS-B/La, Ku (РИФ: окраска флуоресцентным красителем FITC комплекса сывороточных антител со стандартным антигенным субстратом HЕp-2 после их взаимодействия)

И только у 1 пациента с наибольшей продолжительностью заболевания – более 12 лет – впервые выявили антитела к компонентам аппарата Гольджи: гистилину/макрогольгину, гольгину-95/GM130, гольгину-160, гольгину-97, гольгину-245 (см. таблицу 3). Иммунофлуоресцентная микроскопия показала разрывное пятнистое и гранулированное перинуклеарное окрашивание в виде ленты с полярным распределением в цитоплазме (паттерн АС-22; рис. 7).

Рис. 7. ANA к компонентам аппарата Гольджи (РИФ: окраска флуоресцентным красителем FITC комплекса сывороточных антител со стандартным антигенным субстратом HЕp-2 после их взаимодействия)

Как известно, аппарат Гольджи выполняет накопительную и выделительную функцию в клетке. Антитела к этому органоиду могут свидетельствовать о его структурных нарушениях. Подобный вид антител часто выявляют при смешанной болезни соединительной ткани, системной красной волчанке, гранулематозе с полиангиитом.

У пациентов с системной склеродермией впервые выявлено наличие антител к PM/Scl-комплексу (экзосоме), что предположительно указывает на наличие перекрестного синдрома полимиозита и системной склеродермии (см. таблицу 3). Флуоресцентная микроскопия показала гомогенное свечение ядрышек и одновременно более слабое, мелкозернистое свечение нуклеоплазмы. В митотических клетках хромосомы не окрашены и окружены областями мелкокрапчатого свечения (паттерн АС-8; рис. 8).

Рис. 8. ANA к PM/Scl-комплексу (экзосоме) у пациента с системной склеродермией (РИФ: окраска флуоресцентным красителем FITC комплекса сывороточных антител со стандартным антигенным субстратом HЕp-2 после их взаимодействия)

Функция экзосомы заключается в проявлении экзорибонуклеолитической активности, разрушение молекулы РНК начинается с 3′-конца, то есть она способна разрезать РНК в сайтах, расположенных во внутренней части молекулы. Антитела к экзосоме нарушают процесинг различных видов РНК.

Результаты исследования основных патогенетических факторов развития очаговой склеродермии у 19 пациентов с клиническими проявлениями на кожных покровах феномена синдрома Рейно свидетельствуют о различной индивидуальной выраженности перечисленных симптомов и репертуара ААТ.

Очевидно, давность заболевания обследованных пациентов взаимосвязана с локализацией мишеней поражения и степенью выраженности деструкции тканей. Как известно, склеродермия в отличие от других системных коллагенозов развивается без видимой воспалительной реакции, но часто характеризуется поражением ткани, вплоть до некроза сосудистой стенки.

Выводы

вверх

В работе выявлены дополнительные факторы аутоиммунизации, влияющие на определенные механизмы патогенеза при миастении и склеродермии. Наряду с типичными патогенетическими факторами данное исследование позволило выявить наличие ANA при определенных клинических фенотипах миастении и склеродермии.

Известно, что наиболее характерным при миастении является наличие ААТ против различных субъединиц нАХР, так как они могут экранировать и повреждать постсинаптическую мембрану и ингибировать синаптическую передачу. ААТ к α1-субъединице нАХР выявлены нами у всех обследованных больных с тимус-зависимой и тимус-независимой миастенией, максимальный титр был у пациентов с миастенией без структурно-функциональных нарушений тимуса. А у больных с МТ выявили наличие ААТ к другой аутоиммунной мишени – α7-субъединице нАХР. Роль аутоиммунных антител до сих пор не совсем понятна: являются ли они патогенными, либо только специфичными для заболеваний, могут ли служить предикторами исхода заболевания, являются ли защитой от патологического процесса или служат сигнатурой возбудителя аутоиммунитета [13].

Н. В. Бобкова (2008) показала, что ААТ к определенным сайтам α7-субъединицы нАХР могут защищать нейроны от нейротоксического действия эпигеномных средовых факторов при такой грозной патологии, как болезнь Альцгеймера. Для коррекции патологического процесса авторами были получены синтетические пептиды – аналоги данного типа ААТ к α7-субъединице нАХР, которые обладали регуляторной нейротрофической и нейропротективной активностью [2]. В эксперименте подобное действие может формироваться в результате пассивной иммунизации антителами к этому пептиду с последующим его связыванием. Иммунизирование животных восстанавливало плотность α7-субъединиц нАХР, это подтверждает защитный механизм данной иммунизации [2].

При аутоиммунных заболеваниях центральные механизмы утраты аутотолерантности в костном мозге и тимусе могут происходить во многих клеточных субпопуляциях иммунокомпетентных клеток, что приводит к развитию аутоиммунных процессов во многих тканях организма.

Проведенный нами дальнейший поиск дополнительных аутоиммунных мишеней при разных формах миастении с помощью различных методических подходов позволил выявить наличие специфических ANA только у больных с тимомами на фоне миастении. Выявлены ANA преимущественно к структурам, участвующим непосредственно в митотическом делении клеток: центромерам, центромерному белку F, центросомному белку ахроматинового веретена NuMa, что ассоциировано с прямым воздействием на течение клеточной пролиферации, а также репаративные и регенеративные процессы в тканях, в том числе в синапсах и тимусе.

ААТ к центросомному белку NuMA, участвующему в расхождении хромосом к полюсам митотического веретена и стабилизации микротрубочек в нем, а также осуществляющему особую роль в дифференциации нервных клеток, возможно, приводят к нарушению нейро-мышечной передачи у больных с тимомами. Поскольку в центросому входит РНК, которая обладает полифункциональной активностью, при блокировании центросомы может происходить нарушение механизмов нейтро-трансмиттерных реакций.

Кроме того, белки центросомы являются структурными компонентами, участвующими в механизмах, управляющих динамической морфологией клетки в целом [1]. Центросома – это ключевая структура клетки в регуляторных процесах, и нарушение ее функции приводит к аномалиям клеточного цикла, дефектам в дифференцировке тканей и, в конечном счете, к возникновению трофических и онкологических заболеваний [9]. Полученные нами данные о наличии ААТ к центросомальному белку NuMa могут свидетельствовать о нарушении функции центросомы и процесса митоза, что может быть патогенетическим фактором у пациентов с тимомами на фоне миастении. Известно, что изменение формы, размера, структуры и количества центросом наблюдается в клетках агрессивных опухолей [11, 16, 17].

Также у данной категории больных выявили антитела к белкам цитоскелета тропомиозину, с уникальной структурой двойной α-спирали, и цитокератину. Увеличение синтеза некоторых изоформ цитокератинов является маркером малигнизации эпителиальных клеток, и изменение в синтезе различных изоформ тропомиозина ассоциировано со злокачественной трансформацией клеток, что мы наблюдаем у больных со злокачественными местно-распространенными эпителиальными и лимфоидными тимомами.

Как известно, точковые мутации – аминокислотные замены в генах тропомиозина, и повышение конформационной подвижности молекулы тропомиозина ассоциировано с миопатиями [5, 7]. А полиморфизм данного белка может изменять его антигенные свойства, что индуцирует образование антинуклеарных антител. Этот белок выполняет важнейшие функции в регуляции мышечных сокращений и участвует в регуляции структуры и функции актинового цитоскелета, наличие антител к этому белку может приводить к нарушению нейрон-трансмиттерных процессов у больных миастенией.

Известно, что наличие ANA к центромерному белку F, которые были нами выявлены у больных с тимомами, рассматривается другими авторами как маркер малигнизации [1], которая является следствием нарушения механизмов репарации ДНК, и это может быть одним из патогенетических факторов при формировании злокачественных местно-распространенных тимом.

У пациентов с другим аутоиммунным заболеванием – склеродермией – часто выявляют различные антитела, которые также участвуют в патогенезе данного заболевания. Berger M. (2017) показал, что наиболее часто при диффузной прогрессирующей склеродермии встречаются ANA к Scl-70, внутриядерному ферменту топоизомеразе-1, который обеспечивает инициацию и осуществление процесса транскрипции. Данный тип антител выявляют также при дерматомиозите, системном склерозе и системной красной волчанке. Что касается основных этиологических и патогенетических звеньев коллагенозов, то известно, что им предшествуют спе­цифические молекулярные события, которые изменяют интенсивность синтеза белков внеклеточного матрикса фибробластами мышц [10].

В работе при различных формах склеродермии были выявлены антитела к ряду новых аутоиммунных мишеней: PM/Scl-комплексу (экзосоме) при системной склеродермии и рибонуклеопротеинам – U1-nRNP, Sm; аппарату Гольджи, а также анти-SS-A/Ro, анти-SS-B/La и Ku при локальной склеродермии.

Антитела к мультибелковому комплексу PM/Scl – экзосоме, которая обеспечивает разрушение различных типов молекул РНК, могут препятствовать деградации мРНК, рРНК и многих других видов малых РНК.

Выявленные нами антитела при локальной форме склеродермии к рибонуклеопротеинам U1-nRNP, Sm, которые участвуют в процессах альтернативного сплайсинга пре-мРНК, могут нарушать эти процессы и приводить в дальнейшем к изменению синтеза белков межклеточного матрикса.

Таким образом, наличие ANA имеет большую диагностическую и прогностическую ценность. Важной является локальная мишень, с которой связываются антитела. От этого зависят механизмы деструкции тканей и характер метаболических нарушений, затрагивающих интенсивность пролиферации, регуляцию апоптоза, степень выраженности патологического процесса и прогноз течения заболевания.

Наряду с этим ранее в наших работах было показано, что индукция аутоиммунизации при тимус-зависимой и тимус-независимой миастении формируется по центральному или периферическому механизмам утраты аутотолерантности. При нарушении антигенного распознавания в тимусе из-за изменения экспрессии костимулирующих молекул CD28+ на Т-лимфоцитах и функции регуляторных СD25+-Т-лимфоцитов, продуцентов противовоспалительного ИЛ-10, в периферических органах иммунной системы происходит аутоиммунное поражение различных органов-мишеней [14, 15]. Наличие специфических аутоантител к определенным ядерным структурам клетки наряду с другими механизмами аутоиммунизации влияет на различные метаболические механизмы и может быть использовано для адресной терапии с учетом индивидуальных патогенетических звеньев аутоиммунного процесса.

Список литературы

1. Алиева И. Б., Узбеков Р. Э. Центросома – полифункиональный мультибелковый клеточный комплекс. Биохимия. 2008. Т. 73, вып. 6. С. 782-803.

2. Бобкова Н. В. Нейротоксичность бета-амилоида. Механизмы, гипотезы, противоречия. Одиннадцатый международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, 2015. С. 87-89.

3. Госпитальная терапия: учебник / под ред. А. В. Гордиенко. Санкт-Петербург: СпецЛит, 2014. 463 с.

4. Дедаев С. И. Антитела к аутоантигенным мишеням при миастении и их значение в клинической практике. Нервно-мышечные болезни. 2014. № 2. С. 6-15.

5. Ивина А. А., Семкин В. А., Бабиченко И. И. Цитокератин 15 как диагностический маркер начала малигнизации эпителия слизистой оболочки рта. Стоматология. 2018. № 6. С. 61-62.

6. Лапин С. В., Мазинг А. В., Булгакова Т. В., Суркова Е. А., Блинова Т.В и др. Клинические рекомендации по лабораторной диагностике аутоиммунных заболеваний. Москва, 2014. 22 с.

7. Невзоров И. А., Левицкий Д. И. Тропомиозин: двойная спираль из мира белков. Успехи биологической химии. 2011. Т. 51. С. 283-334.

8. Пальцев М. А., Полетаев А. Б., Сучков С. В. Аутоиммунитет и аутоиммунный синдром: границы нормы и патологии. Вестник Российской АМН, 2010. № 8. С. 3-6.

9. Узбеков Р. Э., Алиева И. Б. Центросома – загадка «клеточного процессора». Цитология. 2008. Т. 50, № 2. С. 91-112.

10. Berger M., Steen V. D. Role of anti-receptor autoantibodies in pathophysiology of scleroderma. Autoimmunity Reviews. 2017. V. 16. P. 1029-1035.

11. Brinkley B. R. Managing the centrosome numbers game: from chaos to stability in cancer cell division. Trends Cell Biol. 2001. V. 11. P. 18-21.

12. Denton C. Pathogenesis of systemicsclerosis (scleroderma). Immunotargets Ther. 2016. V. 5. P. 21-35.

13. Fritzler M. Challenges to the use of autoantibodies as predictors of disease onset, diagnosis and outcomes. Autoimmunity Reviews. 2008. V. 7 (8). Р. 616-20.

14. Klimova E. M., Drozdova L. A., Lavinskaya O. V., Minukhin D. V. Individual features of the self-tolerance loss in various clinical manifestation of myasthenia gravis and the rationale for treatment. Norvegian J. of development of the International Science. 2018. Vol. 2. No. 25. P. 28-32.

15. Klimova E. M., Bozhkov A. I., Boyko V. V., Drozdova L. A., Lavinskaya E. V., Skok M. V. Endogenic Cytotoxic Factors and Formation of the Clinic Forms of Myasthenia. Translational Biomedicine ISSN2172-0479. 2016. Vol. 7., No. 3:84. 1-13 p. DOI: 10.21767/2172-0479.100084.

16. Nigg E. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression. Nat. Rev. Cancer. 2002. V. 2. H. 15-25.

17. Pihan G. A., Purohit A., Wallace J., Malhotra R., Liotta L., Doxsey S. J. Centrosome defects can account for cellular and genetic changes that characterize prostate cancer progression. Cancer Res. 2001. V. 61. Р. 2212-2219.

18. Szalat Raphael, Ghillani-Dalbin Pascale et al. Anti-NuMA1 and anti-NuMA2 antibodies: Clinical and immunological features: A propos of 40 new cases and review of the literature. Autoimmunity Reviews. 2010. V. 9 (10). Р. 652-656.

СПЕКТР АНТИГЕННИХ МІШЕНЕЙ АНТИНУКЛЕАРНИХ АНТИТІЛ ПРИ ПЕВНИХ КЛІНІЧНИХ ФЕНОТИПАХ АВТОІМУННОЇ МІАСТЕНІЇ ТА СКЛЕРОДЕРМІЇ

О.М. Климова, Л.А. Дроздова,
ДУ «Інститут загальної та невідкладної хірургії ім. В.Т. Зайцева НАМН України», м. Харків

Резюме

В роботі досліджували можливу патогенетичну роль антитіл до нікотинових ацетилхолінових рецепторів та репертуару антинуклеарних антитіл специфічних до певних ядерних структур, у механізмах формування автоімунних захворювань – певних фенотипів міастенії гравіс і склеродермії. Визначено репертуар антитіл до α1- і α7-субодиниць нікотинових ацетилхолінових рецепторів при різних клінічних формах міастенії, які вважають основним патогенетичним фактором даного захворювання. Виявлено наявність нових молекулярних мішеней автоімунної агресії при різних механізмах втрати автотолерантності: репертуар і частота зустрічальності антинуклеарних антитіл при різних клінічних фенотипах міастенії та склеродермії.

При тимомах на тлі міастенії виявлено антинуклеарні антитіла переважно до структур, які беруть участь у мітотичному поділі клітин: до центромер, до центромерного білка F, центросомного білка ахроматинового веретена NuMa, що асоційовано з прямим впливом на активність клітинної кооперації, проліферації, репаративні та регенеративні процеси в тканинах, у тому числі в синапсах і тимусі.

При різних формах склеродермії були виявлені антитіла до низки нових ядерних автоімунних мішеней: до PM/Scl-комплексу (екзосоми) при системній склеродермії та до рибонуклепротеїнів – U1-nRNP, Sm; апарату Гольджі, а також анти-SS-A/Ro, анти-SS-B/La і Ku при локальній склеродермії. Виявлені спектри антинуклеарних антитіл, які зустрічються тільки при тимус-залежній міастенії і характерні для локальної та системної склеродермії, важливі для розуміння молекулярних механізмів патогенезу різних форм автоімунних захворювань і вибору тактики адресної терапії з урахуванням індивідуальних патогенетичних ланок автоімунного процесу.

Ключові слова: антинуклеарні антитіла, склеродермія, автоімунна міастенія.

THE SPECTRUM OF ANTIGENIC TARGETS OF ANTINUCLEAR ANTIBODIES IN CERTAIN CLINICAL PHENOTYPES OF AUTOIMMUNE MYASTHENIA AND SCLERODERMA

E.M. Klimova, L.A. Drozdova
Zaitsev Institute of General and Emergency Surgery of NAMS of Ukraine, Kharkiv

Abstract

In this work, the possible pathogenetic role of antibodies to nicotinic acetylcholine receptors and the repertoire of antinuclear antibodies specific to certain nuclear structures, in the mechanisms of autoimmune diseases – certain myasthenia gravis and scleroderma phenotypes were investigated. The repertoire of antibodies to the α1- and α7-subunits of nicotinic acetylcholine receptors was determined for various clinical forms of myasthenia, which are considered as a main pathogenetic factor of this disease. The presence of new molecular targets of autoimmune aggression with various mechanisms of self-tolerance loss is revealed: the repertoire and frequency of occurrence of antinuclear antibodies with different clinical phenotypes of myasthenia and scleroderma.

In patients with thymomas on the background of myasthenia, antinuclear antibodies was detected mainly to the structures involved in mitotic cell division: centromeres, centromere protein F, centrosomal protein of the achromatin spindle – NuMa, which is associated with a direct effect on the activity of cell cooperation, proliferation, reparative and regenerative processes in tissues, including in synapses and thymus.

In various forms of scleroderma, antibodies to a number of new nuclear autoimmune targets were detected: to the PM / Scl complex (exosome) in systemic scleroderma and to ribonucleoproteins – U1-nRNP, Sm; Golgi apparatus, as well as anti-SS-A / Ro, anti-SS-B / La and Ku with local scleroderma. The revealed spectra of antinuclear antibodies, which met only with thymus-dependent myasthenia and characteristic of local and systemic scleroderma, are important for understanding the molecular mechanisms of the pathogenesis of various forms of autoimmune diseases and the choice of targeted therapy tactics taking into account the individual pathogenetic links of the autoimmune process.

Key words: antinuclear antibodies, scleroderma, myasthenia gravis.

Поделиться с друзьями: