Разделы: Обзор |

Лабораторные методы диагностики острой, ранней и текущей ВИЧ-инфекции

страницы: 34-40

И.В. Евстигнеев, к.м.н. кафедра госпитальной терапии № 2 с курсом клинической иммунологии и аллергологии ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины»

Evstigneev_4(43).jpg

ВИЧ-инфекция остается главной проблемой общественного здравоохранения в европейском регионе ВОЗ, а в восточной части региона эпидемия ВИЧ развивается наиболее стремительными темпами [1]. Количество людей, живущих с ВИЧ, в Восточной Европе и Центральной Азии с 2000 по 2011 г. возросло втрое, а число новых случаев ВИЧ продолжает увеличиваться [9]. В 2004–2009 гг. ежегодный показатель числа впервые диагностированных случаев ВИЧ в странах Восточной Европы и Центральной Азии вырос на две трети, в то время как в Центральной и Западной Европе он оставался стабильным [7, 8]. Число летальных исходов, обусловленных СПИДом, в Восточной Европе и Центральной Азии за период с 2001 по 2009 г. увеличилось в четыре раза [9]. В соответствии с Европейским планом действий по ВИЧ/СПИДу на 2012–2015 гг. [1] поставлена задача оптимизации методов диагностики при тестировании на ВИЧ, сокращения числа выявленных в поздних стадиях случаев инфекции путем расширения доступа к обследованию, консультированию, повышению уровня обращаемости за этими услугами, особенно для ключевых групп высокого риска.

ВИЧ-инфекция является наиболее серьезным из известных факторов риска активации латентной инфекции, вызванной Мycobacterium tuberculosis. Для ВИЧ-инфицированных лиц с коинфекцией М. tuberculosis риск развития активного туберкулеза составляет 5–10% в год, тогда как для людей, не инфицированных ВИЧ, риск равен 5–10% на протяжении всей жизни [4]. Неуклонное уменьшение количества СD4-лимфоцитов по мере прогрессирования ВИЧ-инфекции приводит к снижению способности иммунной системы сдерживать размножение и диссеминацию М. tuberculosis. Клиническая картина, результаты рентгенографии и бактериологического исследования мокроты легких часто отличаются в ранней (CD4>350/мкл) и в поздней (CD4<200/мкл) стадиях ВИЧ-инфекции. Клинические проявления туберкулеза в ранней стадии сходны с проявлениями заболевания у не инфицированных ВИЧ пациентов: при установлении диагноза учитывают положительные результаты исследования мокроты (двукратное обнаружение в мазках кислотоустойчивых микобактерий туберкулеза или сочетание положительного результата однократного исследования мокроты с характерными рентгенологическими изменениями), а также частое выявление каверн в легких.

Клиническая картина туберкулеза в поздней стадии ВИЧ-инфекции больше напоминает первичный туберкулез: характерно отсутствие М. tuberculosis в мокроте, а при рентгенологическом исследовании в легких часто обнаруживаются инфильтративные изменения, а не каверны [4]. Наряду с прогрессированием иммунодепрессии чаще наблюдаются экссудативные изменения, склонность к генерализации и диссеминации туберкулезного процесса, развитие полисерозитов. Нет четкой корреляции между клиническими, морфологическими проявлениями и степенью иммунодепрессии. Рентгенологически чаще наблюдаются прикорневая аденопатия, милиарные высыпания с интерстициальными изменениями [5].

С 2007 г. и до настоящего времени на основании новых доказательных данных были пересмотрены некоторые клинические рекомендации ВОЗ, касающиеся отдельных вопросов ведения пациентов с сочетанной инфекцией ТБ/ВИЧ [2]. Так, частью обновленного руководства ВОЗ 2010 г. являются рекомендации относительно интенсивной диагностики туберкулеза у ВИЧ-инфицированных пациентов. Целью является обеспечение универсального доступа к бактериологическому исследованию мокроты с определением устойчивости возбудителя к антимикобактериальным препаратам (в том числе с использованием методов быстрой диагностики) [2].

При первичном обследовании пациентов с неизвестным ВИЧ-статусом, у которых обнаружено заболевание из числа часто встречающихся при ВИЧ-инфекции, необходимо предложить тестирование на ВИЧ и консультирование. Первичная оценка ВИЧ-статуса должна включать [3]:

  • дотестовое консультирование;
  • серологическое исследование (как правило, ИФА или экспресс-методы) на антитела (АТ) к ВИЧ с подтверждением полученного результата иммуноблотом (ИБ);
  • послетестовое консультирование, независимо от результатов исследования, включает информирование об изменении поведения, связанного с повышенным риском инфицирования ВИЧ.

При положительном результате тестирования проводят первичное клиническое обследование для определения стадии ВИЧ-инфекции и выявления сопутствующих заболеваний и состояний.

В состав ВИЧ входят структурные гены gag (group specific antigens), pol (polymerase) и env (envelope), кодирующие трансляцию белков, из которых формируется вирус. Ген gag кодирует белки сердцевины вируса. Первичным продуктом его трансляции является р53 – белок-предшественник, который расщепляется на р15, р17, р24 с образованием промежуточного белка р39, из которого в дальнейшем образуются белки р17 и р24. У ВИЧ-инфицированных в большинстве случаев АТ образуются именно к этим антигенам (АГ), причем АТ к р24 выявляют в ранней стадии инфекции, в связи с тем что р24 более иммуногенный, чем р17.

Диагностика ВИЧ-инфекции

Диагностика ВИЧ-инфекции включает два этапа: установление инфицирования ВИЧ и определение стадии заболевания. Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции осуществляется по четырем направлениям:

  • индикация ВИЧ и его АГ;
  • обнаружение специфических АТ к АГ вируса;
  • выявление провирусной ДНК и РНК ВИЧ;
  • выделение вируса.

Иммуноферментный анализ (ИФА, enzyme immunoassay) – первый этап в обследовании, определяющий суммарные АТ к ВИЧ. ИФА используется как метод скрининга, а ИБ – окончательный серологический метод верификации, определяющий наличие АТ к отдельным белкам ВИЧ. В ИБ подтверждается 97–98% случаев ВИЧ-инфицированности у пациентов (при дважды положительных результатах ИФА с использованием разных тест-систем). Для определения АГ и АТ методом ИФА используется твердофазный вариант с иммобилизацией одного из компонентов реакции на твердой фазе (пластиковых планшетах). В частности, АГ ВИЧ зафиксированы на дне лунок планшетов; при наличии АТ к ВИЧ в сыворотке крови происходит образование комплекса АГ–АТ. Эффективность иммобилизации АГ на пластике в лунках во многом зависит от качества этого материала, учитывая, что при проведении анализа дважды осуществляется отмывка планшетов. Прочность связывания АГ ВИЧ с пластиком влияет на чувствительность ИФА (важно, чтобы при промывке сохранялась прочная фиксация комплекса АГ–АТ на стенках лунок).

Для тест-систем ИФА важным условием эффективного использования является качество АГ ВИЧ. Часто применяются вирусные лизаты, однако более предпочтительны наборы с иммобилизацией рекомбинантных вирусных белков, позволяющие повысить чувствительность и специфичность теста. Существует четыре поколения тест-систем ИФА:

  • первое поколение (лизатные тесты): на стенки лунок пластикового планшета в качестве АГ иммобилизированы лизаты культуры лимфоцитов, зараженных ВИЧ;
  • второе поколение: в качестве АГ на планшетах используются рекомбинантные белки и/или пептиды; определяются АТ как к ВИЧ-1, так и к ВИЧ-2, эти наборы более специфичны, чем тест-системы первого поколения, чувствительность – та же;
  • третье поколение: тесты на основе рекомбинантных белков и/или синтетических пептидов; определяются IgM и IgG к ВИЧ, улучшена чувствительность и специфичность (не менее 95–97%);
  • четвертое поколение: совмещенные тесты с иммобилизацией АГ и рекомбинантных АТ. Тест-системы позволяют определять р24-АГ и АТ к нему, чувствительность и специфичность – не менее 99%.

Тесты ИФА третьего и особенно четвертого поколения позволяют сократить интервал времени от момента инфицирования пациента до момента возможности выявления АТ (высокочувствительные тест-системы). При тестировании образцов крови в тест-системах ИФА преследуются три цели:

  • обеспечение безопасности трансфузии крови и ее препаратов;
  • эпиднадзор, мониторирование распространенности ВИЧ-инфекции;
  • диагностика ВИЧ-инфекции.

Чувствительность наборов ИФА находится в пределах 93–99%; большинство тест-систем ИФА для определения АТ к ВИЧ, выпускаемых в странах Западной Европы, имеют чувствительность около 99%. Алгоритм диагностики ВИЧ-инфекции методом ИФА представлен на рис. 1. Результаты ИФА интерпретируются как положительные, отрицательные и неопределенные. Ложноотрицательные результаты могут наблюдаться в начальной стадии первичной инфекции и при тяжелой иммунодепрессии в поздних стадиях СПИДа, при неправильной лабораторной обработке образцов крови. Ложноположительные результаты бывают у больных с аутоиммунными заболеваниями, множественной миеломой, гемофилией, при инфекции, вызванной вирусом Эпштейна–Барр, алкогольном гепатите, при неправильной лабораторной обработке образцов крови. ВОЗ рекомендует проводить дополнительный тест с использованием тест-наборов ИФА с отличающейся антигенной специфичностью. Общепринятым подтверждающим тестом положительных реакций в ИФА является ИБ.

Evstigneev_4(53)_1.gif

Определение маркеров ВИЧ-инфекции с использованием ИФА-диагностикумов ИФА–ВИЧ–АТ/АГ

Диагностика ВИЧ-инфекции в центрах по профилактике и борьбе со СПИДом осуществляется в два этапа: первичный скрининг – ИФА в планшетном формате; подтверждение первичного положительного результата методом ИБ. Тест-системы ИФА–ВИЧ–АТ/АГ позволяют одновременно выявить суммарные АТ к отдельным белкам ВИЧ-1, ВИЧ-2 и АГ р24 ВИЧ. На стенки лунок пластиковых планшетов иммобилизированы рекомбинантные АГ (gр120, gр41, gр36, р24, р31) и отдельно – моноклональные АТ к АГ ВИЧ-1 р24. Тест-системы содержат белковые компоненты ВИЧ-1 трех групп: env (gp41, gp120); gag (p24); pol (p31) и АГ gp36 ВИЧ-2. ИФА-диагностикумы ИФА–ВИЧ–АТ/АГ могут быть использованы для проведения дифференциальных исследований при получении положительных результатов скрининга в тест-системах, выявляющих комплекс АГ–АТ. Возможность определения АГ р24 ВИЧ-1 раздельно и одновременно с АТ к ВИЧ позволяет сократить сроки установления клинического диагноза.

Экспресс-методы в диагностике ВИЧ-инфекции

В последнее время часто стали широко использоваться экспресс-методы диагностики, основанные на принципах ИФА. При работе с большинством наборов результаты могут быть получены в течение 10–15 мин. Методы экспресс-диагностики ВИЧ подразделяются на 3 группы:

  • основанные на проточном принципе;
  • агглютинационные методы;
  • с использованием капиллярого потока.

Наиболее современные тест-системы для экспресс-диагностики основаны на принципе капиллярного потока (иммунохроматографические). При этом вирусные АГ конъюгируются с коллоидным золотом или селеном. Капля крови или другой жидкости наносится на абсорбирующую полоску, содержащую необходимые реагенты и конъюгаты. В результате капиллярного потока образца при наличии противовирусных АТ в крови или другой исследуемой жидкости на тестовой полоске возникает цветная реакция. Также при положительном результате правильность проведения теста подтверждает появление контрольной полоски. При отрицательном результате правильно проведенного теста появляется только контрольная полоска. При неправильном проведении экспресс-теста не определяется ни одна из полос. Экспресс-тесты также называются простыми, или быстрыми, тестами.

Исследование слюны на наличие АТ к ВИЧ

При необходимости обследования значительного контингента населения на наличие в слюне АТ к ВИЧ (чаще эпиднадзор для суждения о распространенности ВИЧ в конкретном регионе) используется экспресс-тест, основанный на принципе ИФА. К часто используемым тест-системам относятся Oral Specimen Collection Device (SmithKline Beecham), Omni-SAL (Saliva Diagnostic Systems), GAC ELISA (IgG antibody capture ELISA) и др. Чувствительность и специфичность этих тестов – около 99%. На втором этапе положительные результаты этих тестов подтверждаются ИБ.

Иммуноблот

Окончательный диагноз ВИЧ-инфекции устанавливается при положительных результатах ИБ (рис. 2). При проведении этого метода используется нитроцеллюлозная полоска с нанесенными на нее вирусными белками. После инкубации сыворотки определение наличия АТ к некоторым белкам ВИЧ проводится с использованием иммуноферментного метода. В соответствии с критериями American CDC результат ИБ считается положительным при наличии двух из трех полосок: gp41, p24, gp120/gp160; American FDA – трех полосок: р24, р31 и одной из двух – gр41 или gр120/gр160 .

Evstigneev_4(53)_2.gif

ВОЗ рекомендует следующую оценку результатов ИБ:

  • положительный результат – определение в сыворотке крови АТ к двум вирусным белкам из группы env при наличии или отсутствии белков – продуцентов gag и pol;
  • отрицательный результат – отсутствие АТ;
  • неопределенный результат – выявление в сыворотке крови АТ к белкам из групп gag и pol.

Неопределенный результат ИБ чаще обусловлен белками – продуцентами экспрессии гена gag ВИЧ-1 р15/р17, р24 и р55; в этих случаях возможен положительный или ложноположительный результат. Окончательный диагноз устанавливается при использовании высокочувствительных методов, в частности ПЦР. Также рекомендуется повторить ИБ через 1 мес. Альтернативным вариантом является использование тест-систем ИФА–ВИЧ–АТ/АГ с определением, кроме суммарных АТ к ВИЧ, р24-АГ.

При использовании ИБ могут наблюдаться ложноположительные результаты при некоторых заболеваниях и состояниях: поликлональной гаммаглобулинопатии, системных заболеваниях соединительной ткани, гипербилирубинемии, перекрестной реакции с другими вирусными АГ.

Определение АГ р24 с использованием тест-систем ИФА

Проблема ранней диагностики ВИЧ-инфекции может быть решена с помощью использования двух методик – реакции ПЦР для обнаружения РНК и высокочувствительного теста для выявления р24-АГ ВИЧ-1. После инфицирования ВИЧ-маркеры, идентифицирующие инфекцию, появляются в сыворотке в следующем порядке: вирусная РНК, р24-АГ и АТ к вирусным белкам. Считается, что использование ПЦР для выявления вирусной РНК является «золотым стандартом», позволяющим обнаружить инфекцию в наиболее ранние сроки. Ограничение применения методики связано с необходимостью предварительной обработки плазмы.

При определении р24-АГ методом ИФА плазма или сыворотка крови используются без предварительной обработки. Преимуществом также является стабильность р24 по сравнению с РНК ВИЧ. Коммерческие тесты для определения р24 в основном имеют чувствительность 3–9 пг/мл. Такие тест-системы сокращают интервал серонегативного «окна» по сравнению с тестами IV поколения ИФА со средней чувствительностью 25–50 пг/мл.

Созданы еще более чувствительные иммуноферментные тест-системы для выявления р24-АГ ВИЧ-1, в частности «ДС–ИФА–ВИЧ–АГ-Скрин» с чувствительностью 0,5 пг/мл [6]. Эта тест-система позволяет значительно сократить фазу серонегативного «окна» по сравнению с тестами с более низким порогом чувствительности. Основной белок сердцевины ВИЧ (р24) может использоваться как дополнительный маркер в диагностике ранней фазы ВИЧ-инфекции, когда АТ отсутствуют или их концентрация настолько низкая, что даже очень чувствительные тест-системы ИФА не могут их выявить. Определение р24-АГ также помогает в установлении наличия ВИЧ-инфекции в более поздних ее стадиях, когда на фоне иммунодепрессии снижается синтез АТ к вирусу и их титр находится в концентрациях ниже разрешающей способности тест-систем ИФА.

Определение р24-АГ наиболее целесообразно в ранней стадии ВИЧ-инфекции и в более поздних стадиях при отсутствии АТ по результатам ИФА и при наличии оснований предполагать ВИЧ-инфекцию.

В иммуноферментных тест-системах для выявления р24-АГ с чувствительностью 0,5 пг/мл используется одностадийный сэндвич-вариант постановки с поэтапным внесением конъюгатов. При этом достигается высокий уровень чувствительности анализа за счет процесса амплификации сигнала при взаимодействии биотина со стрептавидин-пероксидазой. Тест-системы для определения р24 с чувствительностью 0,5 пг/мл способны выявлять АГ в тот же период времени после заражения, что и вирусную РНК методом ПЦР, и на 2–7 дней раньше, чем тест-системы для определения р24 с более низкой чувствительностью.

Идентификация р24 подтверждает наличие ранней стадии ВИЧ-инфекции, служит ее дополнительным маркером и показателем активации репликации вируса, позволяет повысить контроль при заготовке крови и ее препаратов.

Эффективность выявления ранней ВИЧ-инфекции с использованием иммуноферментных тест-систем для обнаружения р24-АГ ВИЧ-1 с чувствительностью 0,5 пг/мл значительно выше, чем тест-систем с более низкой чувствительностью, выявляющих р24, и сравнима с тестами, определяющими вирусную РНК методом ПЦР. Важным преимуществом является непродолжительное время анализа. Так, при использовании тест-системы «ДС–ИФА–ВИЧ–АГ-Скрин» оно составляет 1 ч 55 мин [6]. Иммуноферментные тест-системы для определения АГ р24 с чувствительностью 0,5 пг/мл могут быть эффективно использованы для проведения скрининга донорской крови, обследования лиц из группы риска для ранней диагностики ВИЧ-инфекции.

Полимеразная цепная реакция

ПЦР можно регистрировать по завершении амплификации (по конечной точке) либо на протяжении всей реакции (в реальном времени). В «классической» ПЦР анализ результатов проводится по конечной точке. С этой целью используется несколько методов: электрофорез в геле, гибридизационно-ферментный анализ (ГиФА), флуоресцентная детекция после ПЦР (FLASH) и др. Эти методы определяют количество продукта по завершении процесса, статически характеризуя динамический процесс. Методы ГиФА и FLASH более специфичны по сравнению с электрофорезом ДНК в результате повышения специфичности пробы к целевому амплификату. Преимуществом ПЦР в реальном времени (real time PCR) является оценка исходного количества копий ДНК в образце.

Недостатки ПЦР-анализа:

  • ложноотрицательные результаты;
  • ложноположительные результаты;
  • отсутствие точности количественных ПЦР-исследований;
  • невоспроизводимость результатов.

Причины ложноотрицательных результатов ПЦР-анализа:

  • низкая устойчивость реагентов при хранении;
  • низкая чувствительность метода детекции продуктов реакции;
  • неправильный подбор праймеров;
  • потеря нуклеиновых кислот при заборе;
  • неоптимизированные условия с низкой эффективностью реакции.

Причины ложноположительных результатов ПЦР-анализа:

  • неправильная интерпретация результатов (электрофореза в геле, флуоресцентных сигналов при проведении FLASH);
  • перекрестная контаминация образцов;
  • неправильный выбор праймеров.

Основные причины невоспроизводимости результатов ПЦР-анализа:

  • недостаточно обученный персонал;
  • неправильная организация метода измерения количества ДНК/РНК, отсутствие в тест-системе количественного внутреннего стандарта с учетом потери нуклеиновых кислот при подготовке проб и проведении реакции;
  • неправильная эксплуатация оборудования;
  • отсутствие ежедневного внутрилабораторного контроля и стандартизации разных партий реагентов;
  • контаминация реагентов и образцов.
Использование ПЦР как высокоспецифичного метода позволяет установить окончательный диагноз при неопределенном результате ИБ.

Применение ПЦР в качестве основного лабораторного метода, подтверждающего наличие ВИЧ-инфекции, допускается только в отношении новорожденных детей, матери которых являются ВИЧ-инфицированными.

Таким образом, для выявления ВИЧ-инфекции используют три теста:

  • ИФА-скрининг – тест имеет высокую чувствительность, хотя менее специфичен, чем ИБ;
  • estern-blot, или ИБ, – позволяет установить наличие ВИЧ-инфекции;
  • определение р24-АГ – выявляется на протяжении примерно 2 нед ранней стадии ВИЧ-инфекции.

Острая, ранняя и текущая ВИЧ-инфекция как стадии лабораторной классификации

Определение срока инфицирования ВИЧ прежде всего необходимо для проведения эпидемиологического мониторинга. Появляется возможность оценить два важных показателя – распространенность (prevalence) ВИЧ-инфекции и частоту новых случаев (incidence), необходимых для оценки течения эпидемии. С учетом устойчивого сочетания лабораторных критериев выделяют:

  • острую (acute) инфекцию – соответствует клинической стадии инкубации;
  • раннюю (recent) инфекцию – соответствует клинической стадии первичных проявлений;
  • текущую (established) инфекцию – все остальные клинические стадии за исключением последних стадий СПИДа;
  • серореверсию (снижение уровня титра антител к ВИЧ на фоне выраженной иммунодепрессии в поздних стадиях СПИДа, когда чувствительность тест-систем ИФА не позволяет установить низкий титр АТ к ВИЧ).

Выявление острой ВИЧ-инфекции

Определение острой ВИЧ-инфекции важно для контроля безопасности трансфузии донорской крови и ее препаратов. Выявление ранней ВИЧ-инфекции дает возможность определить ряд показателей для эпиднадзора.

Динамика маркеров в период ранней ВИЧ-инфекции представлена на рис. 3. При острой инфекции ДНК ВИЧ-1 в клетках крови определяется на 5–6-й день заражения и в течение всего инфекционного процесса. РНК ВИЧ-1 (в высоких титрах) в сыворотке крови выявляется на 5–6-й день инфицирования и до сероконверсии (продолжительность периода определения – около 3–4 нед). Репликация ВИЧ уменьшается ниже уровня определения методом ПЦР в результате пока еще эффективного Т-клеточного иммунного ответа. При острой инфекции р24-АГ начинает выявляться в плазме крови с 11–16-го дня после заражения и может быть обнаружен в течение примерно 2 нед. Таким образом, р24-АГ определяется позже РНК ВИЧ, и продолжительность его выявления – меньше.

Через 3–4 нед после инфицирования активируется гуморальный иммунный ответ. В крови появляются АТ к АГ ВИЧ – р24, gp41 и gp120, наблюдается сероконверсия, она может сохраняться до 3 мес. Сероконверсия совпадает с окончанием острой инфекции. В дальнейшем происходит снижение эффективности Т-клеточного ответа, прогрессирующее до выраженной иммунодепрессии в поздних стадиях СПИДа.

Evstigneev_4(53)_3.gif
Когда ВИЧ-инфекция находится в острой стадии (до появления АТ к АГ вируса), ИФА дает отрицательный результат в определении АТ. С целью более раннего подтверждения наличия инфекции дополнительно могут использоваться тесты для определения р24-АГ и РНК ВИЧ. Вирусная нагрузка на самых ранних этапах ВИЧ-инфекции очень высока и составляет от 104 копий РНК в 1 мл, более низкие значения свидетельствуют об окончании острой фазы инфекции.

При определении РНК ВИЧ-1 возможны ложноположительные результаты вследствие контаминации. При этом определяются низкие значения вирусной нагрузки (менее 5 000 копий РНК в 1 мл). Такой результат оценивается как ложноположительный. В этих ситуациях может быть целесообразно проведение теста на ДНК ВИЧ. При возможности одновременного исследования АТ к ВИЧ и вирусной нагрузки острую ВИЧ-инфекцию установить нетрудно. Обнаружение репликации вируса с использованием ПЦР с чувствительностью около 50 копий РНК в 1 мл крови и отсутствие АТ к ВИЧ, выявленное ELISA-тестом, соответствует острой ВИЧ-инфекции.

Если вирусная нагрузка равна 50–5 000 копий РНК в 1 мл, что не соответствует острой фазе ВИЧ-инфекции, необходимо исследовать новый образец крови. При таком положительном результате ПЦР и отрицательном – на АТ к ВИЧ необходимо исключить возможность контаминации. Повторное обнаружение вирусной нагрузки 50–5 000 копий РНК в 1 мл при отрицательном результате определения АТ предполагает необходимость исследования еще одного образца крови. При подтверждении предыдущего результата анализ трактуется как неопределенный, пациент должен находиться под серологическим контролем. Лабораторный алгоритм выявления острой ВИЧ-инфекции представлен на рис. 4.

Evstigneev_4(53)_4.gif
Таким образом, лабораторный диагноз острой ВИЧ-инфекции устанавливается при высоких показателях РНК ВИЧ (>5 000 копий в 1 мл) при отрицательном результате ИФА на наличие АТ.

Диагностика ранней ВИЧ-инфекции

Результаты скринингового тестирования на АТ к ВИЧ тест-системами ИФА используются в эпидемиологических исследованиях для определения частоты встречаемости ВИЧ-инфекции. Значимым показателем является частота новых случаев инфекции. Для его оценки необходимы лабораторные тесты, позволяющие различить раннюю и текущую ВИЧ-инфекцию. Эти методы основаны на выявлении изменений содержания и свойств АТ при развитии гуморального иммунного ответа на ВИЧ-1 в зависимости от интервала времени с момента заражения. На протяжении сероконверсии (3–4 нед) титр АТ невысокий, авидность АТ (связывающая способность) и их аффинность (степень родства к вирусным АГ) также невысокие. В дальнейшем на протяжении 6 мес и более постепенно нарастает титр АТ, повышается их аффинность и авидность.

Также происходит изменение спектра иммуноглобулинов, специфичных к АГ ВИЧ. В первые 3 мес преобладают IgG3-АТ к p24-АГ, к 4–6-му месяцу повышается содержание иммуноглобулинов изотипа IgG1; IgG3 в этом интервале не определяются. С учетом аффинности, авидности изотипов IgG3 и IgG1 к р24-АГ можно разграничить случаи недавнего заражения ВИЧ-инфекцией и более позднюю инфекцию.

По окончании периода ранней ВИЧ-инфекции титр АТ находится на постоянном уровне в течение всего инфекционного процесса. Только в последних стадиях СПИДа возникает серореверсия со снижением титра АТ к ВИЧ в связи с иммунодепрессией, в том числе с угнетением гуморального иммунитета.

Основным методом, используемым для диагностики ранней ВИЧ-инфекции в странах Западной Европы, является sensitive/less sensitive (SLS) EIA test, или STARHS (Serologic Testing Algorithm for Recent HIV Seroconversion). Одновременно с ним проводится исследование образца сыворотки крови в двух ИФА-тестах одинакового формата, но с различной чувствительностью. Снижение чувствительности осуществляют путем разведения образца сыворотки крови и уменьшения времени инкубации.

У пациентов с текущей инфекцией определяется высокий титр АТ, в том числе и в низкочувствительной версии анализа. У лиц с ранней ВИЧ-инфекцией, соответствующей клинической стадии первичных проявлений, титр АТ невысокий, в низкочувствительной версии SLS-EIA АТ не выявляются, а только в высокочувствительной при достаточном времени инкубации и без разведения образца сыворотки крови.

Другой метод, позволяющий разграничить раннюю и текущую стадии ВИЧ-инфекции, основан на разной скорости образования АТ классов IgG к ВИЧ в процессе формирования гуморального ответа. Используется метод изотипспецифического ИБ к основным белкам ВИЧ; конъюгатами являются иммуноглобулины изотипов IgG1 и IgG3 (рис. 5). Интенсивность полос, соответствующих р24-АГ в ранних стадиях ВИЧ-инфекции, существенно различается для IgG1 и IgG3. IgG1 образуются быстро, и АТ этого изотипа сохраняются в последующем. Иммуноглобулины изотипа IgG3 к р24-АГ исчезают из крови в среднем через 2,5–3 мес (30–120 дней).

Evstigneev_4(53)_5.gif
Метод изотип-специфического ИБ позволяет определить образцы «ранних» сывороток у лиц с ВИЧ через 2–4 мес после инфицирования.

Однако тест не может достоверно выявить различия для IgG1 и IgG3 к р24-АГ после 4 мес в течение всего периода ранней инфекции (до 12 мес).

Серореверсия

При серореверсии наблюдается не истинное исчезновение АТ к ВИЧ, а снижение их титра ниже уровня, определяемого в тест-системах ИФА. Серореверсия в последних стадиях СПИДа обусловлена несостоятельностью гуморального иммунного ответа или усилением репликации вируса с повышенным образованием иммунных комплексов, в состав которых вошли свободные АТ к ВИЧ, поэтому их невозможно определить в скрининге с использованием тест-системы ИФА.

Проведение у этих лиц подтверждающего теста ИБ позволяет определить лишь отдельные полосы к белкам env ВИЧ. В этих ситуациях применение ПЦР для выявления провирусной ДНК ВИЧ позволяет определить инфекцию с чувствительностью около 99%. С другой стороны, тяжелые клинические проявления заболевания у этой категории больных легко распознаются.

У пациентов, начавших лечение в ранних стадиях ВИЧ-инфекции, может в редких случаях возникать серореверсия со снижением титра АТ ниже порога определения в наборе ИФА. В этих ситуациях серореверсия объясняется снижением гуморального ответа на фоне уменьшения вирусной нагрузки.

ВИЧ-инфекция и туберкулез, по определению ВОЗ, являются наиболее социально значимыми и прогностически опасными инфекциями. Особенно остро стоит вопрос туберкулеза, сочетанного с ВИЧ-инфекцией, в связи со значительным распространением последней на фоне резервуара туберкулезной инфекции. ВИЧ-инфекция не только ускоряет развитие, но и усугубляет течение туберкулеза, изменяет его клиническую картину, усложняя установление диагноза. Лабораторные методы должны обеспечивать раннюю диагностику ВИЧ-инфекции и туберкулеза для своевременного лечения больных и проведения профилактических мероприятий.

Список литературы находится в редакции

Поделиться с друзьями:

Книги

сборник - Гиперчувствительность к лекарственным препаратам. Руководство для врачей
сборник - Спадкові захворювання шкіри
сборник - Герпесвірусні нейроінфекції  людини
сборник - Атлас: герпесвірусні нейроінфекцїї
сборник - Дитяча дерматовенерологія
сборник - Иммунодефицитные болезни человека
сборник - Хвороби шкіри жінок у віковому аспекті
сборник - Клиника, диагностика и лечение герпетических инфекций человека: руководство для врачей
сборник - Клиническая иммунология и аллергология