Разделы: Обзор |

Современные методы диагностики герпесвирусных инфекций человека и принципы интерпретации их результатов

Д.В. Мальцев, к.м.н., зам. директораИнститута иммунологии и аллергологии Национального медицинского университета имени А.А. Богомольца

Malzev_1(30).jpgХотя проблеме диагностики герпесвирусных инфекций человека посвящено множество научных публикаций, все еще не существует четкого алгоритма диагностического поиска при различных формах этой патологии. К сожалению, в практической медицине часто отмечаются случаи неправильного выбора лабораторного теста или биологической среды для верификации герпесвирусной этиологии заболевания. Кроме того, нередки ситуации ошибочной интерпретации результатов проведенных исследований, а также определенный диагностический нигилизм по отношению к герпесвирусным агентам. Данная статья призвана пролить свет на современные подходы к рациональной диагностике различных заболеваний, вызванных герпесвирусами человека, и предоставить действенный алгоритм верификации диагноза при тех или иных формах этой патологии.

Основные биологические свойства герпесвирусов человека
Герпетические вирусы относятся к семейству Herpesviridae. Это ДНК-содержащие сложные вирусы, вирион которых имеет икосаэдральный тип симметрии и средний размер 250-300 нм. ДНК герпесвирусов представлена двухнитевой линейной молекулой, содержащей короткий (около 18%) и длинный (около 82%) компоненты [2].
Вирион герпесвирусов построен таким образом, что икосаэдральный капсид белковой природы окружает вирусную нуклеиновую кислоту, образуя вместе с ней структуру, получившую название нуклеокапсида (рис. 1). Капсид имеет двадцать пять граней и состоит из 162 субъединиц (так называемых капсомеров). Снаружи вирусная частица покрыта двухслойной мембраноподобной оболочкой, именуемой суперкапсидом, или пеплосом (плащем), и состоящей из полиаминов, липидов и гликопротеиновых шипов. Последние выполняют роль рецепторного аппарата вируса. При этом между внешней мембраноподобной структурой и нуклеокапсидом располагается так называемая волокнистая оболочка, имеющая белковую природу и получившая название тегумент [14].
В семействе Herpesviridae выделяют три подсемейства:
Alphaherpesvirinae (α-герпесвирусы);
Betaherpesvirinae (β-герпесвирусы);
Gammaherpesvirinae (γ-герпесвирусы).
Герпесвирусные агенты характеризуются убиквитарностью, пантропизмом и оппортунистическими свойствами. Вместе с тем, эти патогены способны к индукции иммунодефицитного состояния в зараженном организме, что приводит к развитию различных суперинфекций. Более того, герпесвирусы могут быть этиологическим фактором ряда потенциально летальных новообразований. На сегодняшний день известно 8 видов вирусов семейства Herpesviridae, вызывающих заболевания исключительно у человека (табл. 1).

Еще одной особенностью герпесвирусов является уникальная стратегия паразитирования, преду­сматривающая возможность развития принципиально разных форм хронической инфекции – латентной (скрытой), персистирующей и реактивированной, с чем связаны многие мировоззренческие и практические проблемы в учении о герпесвирусных инфекциях человека.

Диагноcтические критерии основных клинических форм герпесвирусных инфекций человека
На сегодняшний день различают острую и хроническую формы герпесвирусных инфекций. При этом острая форма называется также первичной инфекцией. Как указывалось выше, хроническая форма инфекции может быть латентной, персистирующей или реактивированной [1].
Первичная инфекция развивается при первом контакте восприимчивого организма с возбудителем и может приобретать скрытое (бессимптомное), стертое, абортивное или же клинически манифестное (классическое) течение. Можно выделить такие диагностические критерии первичной герпетической инфекции человека:
1. Типичная клиническая картина (ветряная оспа для HHV-3, инфекционный мононуклеоз для HHV-4, внезапная экзантема новорожденных для HHV-6 и HHV-7).
2. Идентификация вируса в сыворотке крови, пораженных органах и тканях при помощи современных лабораторных методов (вирусологический метод, ПЦР, ДНК-гибридизация, иммуноморфологические методы).
3. Сероконверсия (появление специфических антител у ранее неиммунизированного человека) и выявление вирус-специфических IgM.
Латентную вирусную инфекцию определяют как наличие вирусного генома в ткани организма-хозяина при отсутствии продукции вирусных частиц [14]. Критериями диагностики этой формы инфекции являются:
1. Отсутствие клинических проявлений болезни.
2. Наличие ДНК и некоторых антигенов вируса в биоптатах различных органов и тканей (ДНК-гибридизация in situ, иммуногистохимический метод, western-blot).
3. Результаты современных лабораторно-инструментальных исследований демонстрируют отсутствие каких-либо значимых нарушений структуры или функции органов, в которых выявлен вирус.
4. Отрицательные результаты тестов для определения молекул вируса в биологических средах (сыворотке крови, слюне, слезе, ликворе, моче, тканевой жидкости и др.), что свидетельствует об отсутствии репродукции вирусных частиц (ПЦР, ДНК-гибридизация, иммуноморфологические методы).
5. Отсутствие специфических IgM и наличие невысокого титра специфических IgG в сыворотке крови (иммунная память).
Под понятием «персистенция вируса» понимают стабильное взаимодействие между вирусным агентом и клеткой, при котором в зараженной клетке происходят нормальные обменные и синтетические процессы и одновременно поддерживается репродукция возбудителя [14]. Диагностические критерии персистирующей инфекции:
1. Клинические проявления отсутствуют или имеют место некоторые системные симптомы болезни (хронический мононуклеоз при HHV-4 инфекции; мононуклеозоподобное заболевание при инфицировании HHV-5, -6, и -7; синдром хронической усталости при инфицировании HHV-6 и -7 и др.).
2. Молекулы вирусного агента выявляются в различных биологических средах (слюне, носовом секрете, смыве с ротоглотки, ликворе, моче, тканевой жидкости), биоптатах тканей и органов какими-либо достоверными лабораторными методами (вирусологический метод, электронная микроскопия, ДНК-гибридизация, ПЦР, иммуноморфологические методы).
3. Вирус не определяется в крови современными методами исследования.
4. Результаты достоверных лабораторно-инструментальных исследований демонстрируют отсутствие каких-либо значимых нарушений структуры или функции органов, в которых выявлен вирус (однако при длительной персистенции возможно развитие склеротических изменений и функциональной недостаточности инфицированных органов).
5. В сыворотке крови выявляются специфические IgG в средних или высоких титрах; специфические IgM отсутствуют.
Реактивированная форма инфекции является результатом возобновления полноценной репликации вирусной ДНК и интенсивной репродукции популяций дочерних вирионов после различного по продолжительности периода латентности или персистенции. Критериями реактивации герпесвирусной инфекции являются:
1. Развитие клинических симптомов тяжелых органных поражений (энцефалита, миелита, полиневрита, пневмонита, эзофагита, гепатита, миокардита, хориоретинита, васкулита и др.), неоплазий (например, В-клеточных лимфом и рака желудка при HHV-4; саркомы Капоши и лимфом серозных оболочек при HHV-8 инфекции и др.), а также картины вирусного сепсиса.
2. Результаты клинических, лабораторных и инструментальных исследований указывают на наличие выраженных нарушений структуры и/или функции тех органов и тканей, где выявлен вирус.
3. Одновременное определение вирусных молекул (ДНК, антигенов капсида и мембраноподобной оболочки) в крови (цельной крови, культуре мононуклеарных клеток, реже – сыворотке крови), биоптатах пораженных органов и соответствующих биологических секретах (например в спинномозговой жидкости – при энцефалите, моче – при нефрите, слезной жидкости – при хориоретините и т. д.).
4. Резкое повышение (в 2-4 раза и более) титра специфических IgG в сыворотке крови при проведении двух серологических исследований с интервалом в 2-3 нед (метод парных сывороток). Иногда повторно появляются специфические IgM (если период латентности был довольно продолжительным).
5. Исключение других причин выявленных патологических нарушений (однако наличие другого инфекционного агента не исключает возможности микст-инфекции с герпесвирусами).

Характеристика основных современных методов диагностики герпесвирусных инфекций
Сегодня существует довольно большое количество разнообразных методов лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций (табл. 2), отличающихся по точке приложения, длительности выполнения, чувствительности и специфичности (табл. 3). Это создает мнимое впечатление о легкости диагностики болезней, вызванных герпесвирусными агентами. Однако важно отметить, что не каждый из приведенных методов может быть достаточно достоверным способом верификации диагноза в конкретных случаях, поэтому для выбора рационального подхода к диагностике клиницист должен быть хорошо осведомлен о потенциальных возможностях того или иного диагностического теста, его преимуществах и недостатках при разных формах герпесвирусных инфекций.
Вирусологический метод. Сущность метода состоит в выделении вируса в культурах чувствительных клеток (например эмбриональных фибробластов) или куриных эмбрионах. Он по-прежнему остается «золотым стандартом» диагностики вирусных инфекций человека, поскольку характеризуется высокой чувствительностью (85-100%) и специфичностью (100%), а также позволяет получить чистую культуру вируса для дальнейшего изучения, в частности испытания чувствительности к противовирусным препаратам.
При этом вирус идентифицируют к культуре клеток по характерному цитопатическому действию, путем проведения электронной микроскопии зараженных клеток или при помощи иммуногистохимического анализа с использованием меченых моноклональных антител к антигенам возбудителя.

Однако существенная дороговизна и трудоемкость препятствуют широкому внедрению вирусологического метода в повседневную клиническую практику. Кроме того, результаты этого исследования получают слишком поздно (от 2 до 20 дней после забора биоматериала), поэтому использовать такую диагностику при неотложных состояниях (например при вирусном энцефалите или сепсисе) нерационально [2].

Электронная микроскопия позволяет выявить вирусные частицы в исследуемом образце (биоптате, культуре клеток, аутопсийном материале) и определить видовую принадлежность вирионов по их морфологическим признакам, однако этот метод все еще малодоступен для клинической практики и используется в основном в научных целях [1].
Биологическая проба состоит в заражении чувствительных лабораторных животных (белых мышей или кроликов) биоматериалом, полученным от больного с герпетической инфекцией. Этот метод может быть использован в спорных случаях герпесвирусной инфекции, например, для диагностики атипического герпетического энцефалита, при сомнительных результатах ДНК-диагностики и иммуноморфологических методов исследования [9].

Сегодня главенствующую роль в верификации герпесвирусных инфекций человека играют методы ДНК-диагностики, в частности полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ДНК-гибридизация.

Гибридизация ДНК – высокоспецифический метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации с комплементарными молекулами ДНК-диагностикума. Метод позволяет определить способность исследуемой вирусной ДНК гибридизироваться (специфически связываться) с меченой комплементарной ДНК известной природы, на основании чего делается вывод о видовой принадлежности исследуемого образца нуклеиновой кислоты. При этом специфичность указанного метода прямо пропорциональна длине комплементарной полинуклеотидной цепочки. В качестве маркера применяют ферменты (например пероксидазу, щелочную фосфатазу) или изотопы. Кроме того, для выявления феномена гибридизации проводят электрофорез в геле, позволяющий дифференцировать электрофоретическую подвижность комплементарной ДНК и комплекса «комплементарная ДНК – ДНК вируса» [2]. Недостатками ДНК-гибридизации является сравнительно длительное время выполнения (в среднем – 5-7 сут), что может создавать существенные затруднения при диагностике ургентных состояний, а также высокая частота ложноотрицательных результатов при низком количестве вирусной ДНК в исследуемой пробе.
ПЦР наиболее широко используемый метод диагностики герпетических инфекций человека – был предложен Мюллисом в 1983 г. В основе метода лежит катализуемое ферментом термостабильной ДНК-полимеразой многократное образование копий (амплификация) определенного участка ДНК, представляющего диагностический интерес. При этом для амплификации, т. е. синтеза ДНК-матрицы, отбирают наиболее консервативную часть вирусного генома, обычно какой-нибудь уникальный ген, который наиболее четко отличает его от прочих патогенов [15].
Этапы метода:
1. Термическое разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки (30-40 с при 93-95 °С).
2. Охлаждение среды.
3. Внесение видоспецифических праймеров, т. е. фрагментов ДНК, комплементарных нуклеотидным последовательностям обеих цепочек ДНК исследуемого возбудителя. Для запуска синтеза на ДНК-матрице используют два праймера, которые являются комплементарными нитям ДНК на обоих концах специфического фрагмента.
4. Внесение термостабильной ДНК-полимеразы, что запускает образование вторичных копий цепей ДНК.
5. Повторный подогрев.
6. Охлаждение среды.
7. Повторное внесение праймеров.
8. Повторение процедур подогрева и охлаждения.
9. После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их идентификацию путем электрофореза или иммунофлуоресцентным методом [8].
Взаимодействие праймеров с ДНК-полимеразой и ДНК-матрицей называется отжигом, поскольку реакция происходит при температуре 50-65 °С. В результате достраивания цепей ДНК под действием ДНК-полимеразы формируется специфический фрагмент – ампликон. Таким образом, ампликон состоит из цепи ДНК-матрицы, праймера и достроенного к нему с помощью ДНК-полимеразы фрагмента полинуклеотидной цепи. Как указывалось выше, после окончания первого цикла проводят повторные, а синтезированные в них ампликоны служат матрицами для последующих этапов. При этом рассчитано, что за 30–40 циклов из одной матрицы можно получить около 108 ампликонов (рис. 2).
Различают качественный, полуколичественный и количественный варианты метода [3]. При проведении качественной ПЦР можно определить лишь факт присутствия вируса, однако невозможно оценить его репродуктивную активность, что неприемлемо при диагностике герпетических инфекций, при которых необходимо проводить дифференциальный диагноз между латентными, персистирующими и реактивированными формами инфекции. Полуколичественная ПЦР дает определенную информацию о содержании копий вирусных ДНК, которая выражается в виде условных обозначений (+, ++, +++, ++++), однако наиболее целесообразно проводить именно количественный вариант метода, при котором можно получить точные числовые значения, отражающие репродуктивную активность вируса.
Надо понимать, что полученный количественный результат не соответствует истинному содержанию ДНК возбудителя в исследуемой пробе ввиду феномена амплификации, который имеет место при проведении ПЦР [16]. Однако все же существует определенная пропорциональность между исходным количеством генетического материла и конечным результатом исследования. Такая пропорциональность соблюдается лишь в случае проведения диагностики в стандартных условиях с использованием одних и тех же реактивов. Поэтому адекватный сравнительный анализ полученных результатов можно проводить только при обследовании пациента в динамике в одной и той же лаборатории. Если же необходимо установить абсолютное количество вирусной ДНК в пробе, то осуществляют нормализацию полученных результатов (сравнение с количеством продуктов некоторых стабильных генов, экспрессия которых одинакова при различных условиях).

ПЦР – высокоточный метод. Теоретически для получения результата достаточно иметь в среде всего одну молекулу ДНК возбудителя. Чувствительность ПЦР составляет 98%, а специфичность – 94% [14].

Ложноотрицательные результаты возможны при несоблюдении технологических процедур проведения исследования, а также при использовании некачественных реактивов. Ложноположительные данные можно получить при подсчете результатов методом электрофореза, что связано с возможностью контаминации воздушной среды рабочего пространства ампликонами, выявленными в ходе предварительных постановок. Поэтому использование так называемых открытых методик подсчета результатов требует проведения надлежащей вентиляции помещений. Предпочтительнее использовать закрытые методики подсчета, например, иммунофлуоресцентные детекторы, при которых нет прямого контакта между продуктами реакции и воздушной средой, а результаты исследования являются более корректными.
Наиболее точной является методика так называемой real-time ПЦР, т. е. ПЦР в реальном времени. Ее отличительным свойством является подсчет количества амплифицированных ДНК по мере их накопления после каждого амплификационного цикла, а не в конце постановки. При этом используются две методики регистрации результатов: при помощи флуоресцентных «красок», которые напрямую взаимодействуют c двухцепочечной (нативной) ДНК возбудителя и обеспечивают ее свечение, и модифицированных ДНК-олигонуклеотидных проб (рис. 3, 4). Последние содержат специфические последовательности ДНК, комплементарные уникальным генам исследуемого патогена, а также флуорофор и «гаситель» (quencher), присоединенные к молекуле-носителю, называемой reporter («переносчик»). Флуорофор отсоединяется от «гасителя» и обеспечивает феномен свечения только после гибридизации специфических олигонуклеотидных последовательностей с комплементарной исследуемой ДНК [13].
Даже количественная ПЦР не всегда позволяет адекватно разграничить латентные и реактивированные инфекции, так как в обоих случаях имеет место наличие вирусной ДНК. Для подобной дифференциальной диагностики используют ПЦР обратной транскрипции (англ. – reverse transcription PCR), с помощью которой можно подсчитать количество вирусной мРНК, которое свидетельствует об интенсивности экспрессии вирусных генов. Высокое количество мРНК патогена в исследуемом образце указывает на реактивированную инфекцию, которая сопровождается интенсивным синтезом вирус-специфических белков [1].
ПЦР как диагностический метод лишена основных недостатков ДНК-гибридизации, в частности характеризуется повышенной чувствительностью, что связано с искусственным повышением содержания вирусной нуклеиновой кислоты в исследуемом материале. Также за счет проведения ПЦР существенно ускоряется время получения результата исследования. Если при ДНК-гибридизации может понадобиться около 5-7 сут, то результат ПЦР-диагностики доступен уже через 3-6 ч после начала проведения [2]. Это преимущество имеет огромное значение при неотложных состояниях, вызванных герпесвирусной инфекцией, когда необходимо установить диагноз в течение суток.

Все эти особенности обеспечили беспрецедентный успех ПЦР как диагностического теста при вирусных инфекциях человека.

Методы определения вирусных антигенов (иммуноморфологические методы) позволяют выявить специфические вирусные молекулы, входящие в состав капсида и мембраноподобной оболочки вирионов. Для их идентификации используют специфические моноклональные антитела, а результат определяют по изменению окраски субстрата в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) или по феномену свечения при использовании метода флуоресцирующих антител (МФА). Специфичность таких методов составляет около 90%, однако чувствительность гораздо ниже, чем у ПЦР (55-75%) [8].

Эти методы в какой-то мере дублируют результаты ПЦР, однако могут быть полезными для контроля качества этого исследования, например, для исключения ложноположительных или ложноотрицательных результатов ДНК-диагностики.

При хронической репродукции герпетических вирусов могут формироваться дочерние популяции, состоящие из так называемых дефектных вирионов – вирусных частиц, не содержащих нуклеиновых кислот (очень часто при HSV-1-инфекции) [8]. Такая ситуация обусловлена истощением пораженных клеток и дефицитом нуклеотидов для репликации ДНК. Кроме того, не исключено, что это может быть защитной реакцией вируса, поскольку фрагменты ДНК являются молекулярными шаблонами, по которым патоген распознается клетками врожденного иммунитета. В любом случае, ПЦР не позволяет выявить вирус, представленный дефектными вирионами, ввиду отсутствия в составе вирусных частиц молекул ДНК, однако результаты исследований, направленных на определение специфических антигенов, будут положительными. С другой стороны, иммуноморфологические исследования могут давать ложноотрицательные результаты при низкой экспрессии вирусного генома в пораженном органе (латентная, иногда – персистирующая инфекция). Поэтому для наиболее точной диагностики необходимо проведение комплексных исследований, включающих определение как вирусных ДНК, так и их антигенов.
Серологические методы (реакции нейтрализации, связывания комплемента, гемагглютинации, иммунофлуоресценции и др.) позволяют оценить характер и напряженность специфического гуморального иммунитета и не предоставляют прямой информации для подтверждения диагноза герпесвирусной инфекции [7].
Наличие противогерпетических IgM свидетельствует об определенной остроте процесса (первичная инфекция, реинфекция, реактивация) [5, 8]. Так, при первичной герпесвирусной инфекции специфические IgM появляются на 7-14-е сутки после заражения и циркулируют 1-3 мес. Однако около 5% людей не продуцируют IgM при первичной инфекции, а у некоторых лиц IgM могут сохраняться на протяжении длительного времени после заражения, что дает ложную информацию об остроте процесса.
Специфические IgG являются антителами вторичного иммунного ответа и выявляются во второй половине инфекционного процесса при первичном заражении, а также в случае латентных инфекций (иммунная память) [6], при персистенции и реактивации патогена. Поэтому определение таких иммуноглобулинов не позволяет точно оценить клиническое значение имеющейся инфекции и не может быть достаточно надежным критерием для установления диагноза и назначения противовирусного лечения [1].
Классический постулат о 4-кратном повышении титров специфических антител за двухнедельный срок (метод парных сывороток) как о диагностическом серологическом критерии инфекции применим лишь для случаев первичного заражения или «свежей» реактивации [1]. При хронических реактивированных формах герпетической инфекции наблюдается чрезвычайно высокий титр специфических IgG (в 5-10 раз выше верхней границы допустимых значений и более). В дальнейших исследованиях этот титр обычно существенно не повышается, так как ресурсы антителогенеза человеческого организма не являются безграничными. Мы акцентируем на этом внимание из-за типичных ошибок, допускаемых в серологической диагностике хронических герпетических инфекций человека.
Резкие изменения титра специфических IgG возможны при переходе вируса из одной формы в другую. Например, существенное увеличение сывороточной концентрации противогерпетических антител возможно при реактивации инфекции после длительного периода латентности. И, наоборот, некоторое снижение титра специфических IgG наблюдается при формировании скрытой инфекции после определенного периода реактивированного состояния. Но зафиксировать эти изменения в клинической практике иногда бывает сложно, что обусловлено сравнительно коротким периодом их существования. Это несколько ограничивает диагностическую ценность такого подхода [3].
Однако проведение серологических исследований весьма полезно для оценки иммунного статуса зараженного организма. Так, например, диссоциация между результатами ПЦР, демонстрирующими высокую репродуктивную активность вируса, и серологическими данными, показывающими низкие титры специфических антител, может быть диагностическим критерием недостаточности противогерпетического гуморального иммунного ответа и показанием к назначению иммунотерапии с использованием средств, повышающих антителогенез (миелопид, спленин, полиоксидоний и др.), или препаратов специфических иммуноглобулинов [7]. И, наоборот, чрезмерно высокая концентрация антител в условиях быстрого распространения вируса указывает на низкую аффинность и/или авидность продуцируемых иммуноглобулинов и определенный риск иммунокомплексной патологии (васкулиты, гломерулонефрит и др.). Это также может служить показанием к проведению определенных терапевтических вмешательств: иммуноглобулинотерапии, плазмафереза или лечения препаратами, модулирующими фагоцитарную активность макрофагов для повышения эффективности элиминации циркулирующих иммунных комплексов (полиоксидоний, галавит, иммуномакс и др.) [3]. Существуют специальные методики для оценки силы связывания специфических антител с диагностикумами, содержащими антигены вирионов герпесвирусов (тесты на аффинность/авидность антител), которые можно провести в указанных случаях для верификации патологии [8].
Цитологические и гистологические исследования позволяют выявить характерные для герпесвирусов признаки поражения клеток, органов и тканей. Классический пример – феномен цитомегалии, наблюдаемый при HHV-5 инфекции. Зараженные патогеном клетки приобретают крупный размер, их ядра также становятся необычно большими, располагаются исключительно эксцентрично и содержат центральное нуклеарное тело в виде темной округлой массы, окруженной зоной прозрачной кариоплазмы – так называемым гало (англ. – halo) [17, 18]. В цитоплазме модифицированных клеток располагается множество включений, представляющих собой вирусные частицы [10, 11] (рис. 5). Такие клетки получили название цитомегалических, что в переводе с латинского языка буквально означает «большие клетки», а сам НHV-5 стали называть цитомегаловирусом.
При поражениях, вызванных α-герпесвирусами (HSV-1 и HSV-2, HНV-3), в гистологических препаратах, полученных из биопсийного материала (эпидермис, эпителий пораженных внутренних органов), определяются так называемые клетки Тцанка. Это крупные (зачастую – гигантские) модифицированные вирусом клетки, имеющие неправильную или овальную форму, аномально большое ядро или сразу несколько ядер и базофильную цитоплазму с перинуклеарным просветлением и феноменом гипербазофилии по периферии (рис. 6). По своей природе гигантские моногоядерные клетки Тцанка являются синцитием, т. е. результатом слияния нескольких зараженных вирусом эпителиоцитов.
HHV-6 также способен оказывать цитопатический эффект, проявляющийся образованием в инфицированной ткани больших шарообразных клеток с цитоплазматическими тельцами вирусных включений (рис. 7) [1].
В формуле крови больных с герпесвирусными инфекциями могут обнаруживаться так называемые атипичные мононуклеары. Эти клетки впервые описаны при инфекционном мононуклеозе, однако они могут выявляться в крови и при других герпетических инфекциях (рис. 8). И.А. Кассирский назвал эти клетки вироцитами, подчеркивая тесную связь между их появлением в периферической крови и наличием вирусной инфекции. Это крупные клетки диаметром около 15-20 мкм овальной или неправильной формы. Цитоплазма широкая и занимает больше половины объема клетки, имеет фиолетовый оттенок, сгущающийся к периферии, из-за чего в центре имеется выраженное перинуклеарное просветление, а вдоль края формируется темный кант (феномен плазматизации). Иногда цитоплазма и ядро атипичных мононуклеаров имеют широкие выросты, благодаря которым эти клетки напоминают моноциты. Плазматизация, напротив, сближает атипичные мононуклеары с плазмоцитами. Ядро атипичного мононуклеара располагается, как правило, эксцентрично. Хроматин в основном гомогенен, содержит отдельные трещины (без картины «гор и долин»). Реже хроматин расположен рыхло, что создает определенное сходство с пролимфоцитом [4]. Содержание атипичных мононуклеаров при герпетической инфекции широко варьирует: от 1-3% при мононуклеозоподобном синдроме, вызванном HHV-5 и HHV-6, до 10% и более при остром инфекционном мононуклеозе Эпштейна – Барр вирусной этиологии.
Цитологические и гистологические исследования позволяют диагностировать опухоли, которые могут быть клиническим проявлением или осложнением хронической реактивированной герпетической инфекции (например лимфома Беркитта, назофарингеальная карцинома, В- и Т-клеточные лимфомы при HHV-4; Т-клеточные лимфомы при HHV-6 или саркома Капоши (рис. 9) при HHV-8 и др.) [12].

Иммунологические исследования являются обязательными при клинически манифестных формах герпесвирусных инфекций ввиду оппортунистических свойств вирусов и их способности оказывать иммуносупрессивное воздействие на зараженный организм. Результаты таких исследований в ряде случаев могут выявить причину формирования хронической реактивированной инфекции, т. е. установить определенный иммунный дефект. На основании полученных данных можно спланировать рациональную иммунотерапию [3, 7].

Диагностический набор показателей иммунограммы при герпетических инфекциях должен включать проведение общего анализа крови, оценку количества CD3+ (Т-лимфоциты), СD3+CD4+ (Т-хелперы), CD3+CD8+ (цитотоксические Т-лимфоциты), CD3+CD4+CD25+ (регуляторные Т-клетки), CD3-CD16+CD56+ (естественные киллеры), СD3-CD19+ (В-лимфоциты) клеток методом проточной цитофлуориметрии (рис. 10), а также определение их функциональной активности в реакции бласттрансформации или по уровню продукции ряда цитокинов [3, 8].
Именно дефицит цитотоксических Т-лимфоцитов сегодня рассматривается как основное иммунное нарушение, опосредующее развитие реактивированных герпесвирусных инфекций. При этом также особенно важно определять активность спонтанной и индуцированной продукции γ-ИФН лимфоцитами и концентрацию этого цитокина в сыворотке крови, поскольку именно этот медиатор активирует цитотоксические Т-лимфоциты и способствует их созреванию [3].
При острых и хронических герпесвирусных инфекциях существенно отличается интерфероновый статус организма. Так, в случае острого процесса имеет место значительное повышение концентрации интерферонов в сыворотке крови на фоне снижающейся способности лейкоцитов к продукции разных типов интерферона, что отражает нормальную реакцию организма на активную вирусную инфекцию. Напротив, при хронической инфекции концентрация интерферонов в сыворотке крови снижается, но отмечается повышение способности лейкоцитов к продукции данных цитокинов, что можно выявить в соответствующих лабораторных тестах.

Одновременное снижение сывороточных концентраций интерферонов и способности к синтезу интерферонов лейкоцитами свидетельствует о тяжелой иммуносупрессии и угрозе генерализации инфекции [3, 8].

Функциональная активность В-лимфоцитов оценивается по концентрациям антител разных классов в сыворотке крови. Обязательным является определение содержания sIgA в секретах, а также сывороточной концентрации комплемента, поскольку эти гуморальные факторы принимают активное участие в противогерпетическом иммунитете [3].
Необходимо также исследование фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов, так как герпесвирусные агенты часто угнетают эту функцию, способствуя тем самым собственной репродукции и развитию грибковых и бактериальных осложнений.
Целесообразно также определять количество и функциональную активность так называемых больших гранулярных лимфоцитов, что представляет собой интегральный цитологический показатель цитотоксических клеток человеческого организма (естественные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты, γ/δ-Т-лимфоциты, естественные киллерные Т-клетки). Большие гранулярные лимфоциты имеют вид крупных клеток (диаметр – 12-15 мкм) с широким ободком голубоватой или почти бесцветной цитоплазмы (рис. 11). Форма клеток – округлая или овальная. В цитоплазме содержится несколько гранул, окрашивающихся азуром в темно-красный или вишнево-фиолетовый цвет. Круглое или овальное ядро обычно располагается эксцентрично, хроматин гомогенен [4].
Н.И. Лисяный с соавт. (2006) выделяет 4 иммунологических паттерна при герпесвирусной инфекции:
1. Иммуноактивный (высокая концентрация противовирусных антител).
2. Иммунонеактивный (нормальная концентрация противовирусных антител при высокой вирусной нагрузке).
3. Иммунодефицитный (отмечается дефицит или дефекты противовирусных компонентов иммунитета – цитотоксических Т-лимфоцитов, естественных киллеров, интерферонов и т. д.).
4. В-клеточностимулированный (характерно для Эпштейна – Барр вируса, тропного к CD21+-лимфоцитам) [7].
Это обосновывает дифференцированный подход к иммунотерапии герпесвирусных инфекций в зависимости от особенностей иммунного статуса пациента.

Заключение
Герпесвирусная инфекция является чрезвычайно распространенной патологией современного человека, при диагностике которой возникают определенные трудности. Причина этого состоит как в некоторых мировоззренческих проблемах, в частности диагностическом нигилизме по отношению к герпесвирусным агентам, так и в сложной стратегии паразитирования указанных возбудителей, предусматривающей возможность формирования латентной (скрытой), персистирующей или реактивированной форм инфекции.

Поэтому рекомендуемый набор диагностических тестов должен носить индивидуальный характер в каждом конкретном случае.

Методы идентификации вирусной ДНК по праву играют главенствующую роль в современном алгоритме верификации диагноза герпесвирусной инфекции человека, однако параллельное проведение иммуноморфологических тестов может существенно снизить частоту ложноотрицательных результатов ДНК-диагностики. Серологические методы должны использоваться преимущественно для оценки напряженности противовирусного гуморального иммунитета, а не как тесты, подтверждающие диагноз инфекции, кроме случаев первичного инфицирования, когда наблюдаются феномен сероконверсии и появление специфических IgM.
Мы надеемся, что высокая осведомленность клиницистов в вопросах рациональной диагностики герпесвирусных инфекций позволит улучшить выявляемость этой патологии среди населения Украины.


Литература
1. Абатуров А.Б., Шостакович-Корецкая Л.Р. HHV-6 инфекция у детей // Здоровье ребенка. – 2007. – № 3. – С. 70-80.
2. Исаков В.А., Архипова Е.И., Исаков Д.В. Герпесвирусные инфекции человека. – СПб.: СпецЛит, 2006. – 304 с.
3. Казмірчук В.Є., Ковальчук Л.В. Клінічна імунологія та алергологія. Вінниця: Нова книга, 2006. – 526 с.
4. Кременецкая А.М., Воробьев И.А., Сидорова Ю.В. и др. Морфология лимфоцитов // Терапевтический архив. – 1998. – № 7. – С. 37-39.
5. Куртасова Л.М., Савченко А.А., Рузаева Л.А., Шмидт А.Р. Особенности метаболизма иммунокомпетентных клеток у детей с рецидивирующей герпетической инфекцией // Вопросы вирусологии – 2002. – Т. 47, № 3. – С. 45-48.
6. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунная недостаточность (выявление и лечение). – М.: Изд-во НГМА, 2003. – 442 с.
7. Лисяный Н.И., Руденко А.А., Унич П.П., Муравская Л.В. К вопросу о диагностике герпес-инфекций // Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика, лікування хламідіозу та TORCH-інфекцій // Імунологія та алергологія. – 2006. – № 4. – С. 103-194.
8. Мейл Д., Бростофф Дж., Рот Д.Б., Ройт А. Иммунология. – М.: Логосфера, 2007. – 556 c.
9. Finnen R.L., Mizokami K.R., Banfield B.W. et al. Postentry events are responsible for restriction of productive varicella-zoster virus infection in Chinese hamster ovary cells. J. Virol. 2006; 80: 10325-34.
10. Ho M. Cytomegalovirus: biology and infection, 2nd edn, Chap 13. Plenum, New York, 1991; pp 249-300.
11. Ho M. Cytomegalovirus: biology and infection, 2nd edn. Plenum, New York, 1991; p 257, 440 pp.
12. Jones J.F. et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N. Engl. J. Med. 1988; 318: 733-41.
13. Stefan A., Menotti L., Campadelly-Fiume G. Biology and natural history of HHV 6 and 7. Herpes. 1999; 6 (3): 12-21.
14. Steiner I., Kennedy Peter G.E., Pachner A.R. The neurotropic herpes viruses: herpes simplex and varicella zoster. Lancet Neurol. 2007; 6: 1015-1028.
15. Udvardi M.K., Czechowski T., Scheible W.R. Eleven golden rules of quantitative RT-PCR. Plant. Cell. 2008; 20: 1736-1737.
16. Van Guilder H.D., Vrana K.E., Freeman W.M. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. Biotechniques. 2008; 44: 619-626.
17. Von Glahn W.C., Pappenheimer A.M. Intranuclear inclusions in visceral disease. Am. J. Pathol. 1925; 1: 445-465.
18. Wyatt J.P., Saxton J., Lee R.S., Pinkerton H. Generalized cytomegalic inclusion disease. J. Pediatr. 1950; 36: 271-294.

Статья размещена в номере 1(30) 2010 на стр. 23-33

Поделиться с друзьями:

Книги

сборник - Гиперчувствительность к лекарственным препаратам. Руководство для врачей
сборник - Спадкові захворювання шкіри
сборник - Герпесвірусні нейроінфекції  людини
сборник - Атлас: герпесвірусні нейроінфекцїї
сборник - Дитяча дерматовенерологія
сборник - Иммунодефицитные болезни человека
сборник - Хвороби шкіри жінок у віковому аспекті
сборник - Клиника, диагностика и лечение герпетических инфекций человека: руководство для врачей
сборник - Клиническая иммунология и аллергология